[发明专利]一种模拟人类帕金森病的小鼠模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种模拟人类帕金森病的动物模型的构建方法，其特征在于利用基因编辑技术，将携带突变位点的人源SNCA基因蛋白质编码区随机或定位插入动物基因组或者替换动物SNCA基因蛋白质编码区，所述动物模型表达携带A30P、E46K、A53T中至少两种突变的α-Syn蛋白。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述动物模型表达携带A30PE46K、E46KA53T或A30PA53T突变的α-Syn蛋白。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述基因编辑技术包括同源重组、锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应物核酸酶术、CRISPR/Cas9系统、单碱基编辑技术中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于利用基因编辑技术获得转基因打靶载体，通过显微注射法将打靶载体注射入动物受精卵，或者采用ES细胞打靶技术将打靶载体转染入动物ES细胞，或者采用逆转录病毒感染法将目的基因重组到逆转录病毒载体上，感染着床前/后的动物胚胎，或者采用精子载体法经电穿孔将转基因打靶载体导入精子后与卵子结合。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)设计包含携带突变位点的人源SNCA基因蛋白质编码区的DNA同源供体；

(2)将步骤(1)制得的DNA同源供体通过显微注射方式注射入动物受精卵或转染入ES细胞，将携带突变位点的人源SNCA基因蛋白质编码区随机插入到基因组；

或者基于CRISPR/Cas9技术，制备Cas9或其表达载体，在动物SNCA基因蛋白质编码区的5’端和3’端各设计一条sgRNA 或者tracrRNA/crRNA 二元复合体或各自的表达载体；或制备Cas9、sgRNA或者crRNA和tracrRNA的共表达载体，将DNA同源供体、Cas9、sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体，或者各自的表达载体或共表达载体注射入动物受精卵或转染入动物ES细胞，敲除动物SNCA基因蛋白质编码区的同时将携带突变位点的人源SNCA基因蛋白质编码区插入到基因组；

(3)将受精卵移植到代孕母体或者将打靶阳性ES细胞注射到动物囊胚中并将囊胚移植到代孕母体，进行饲养，生产出的后代即为F0代动物，经基因型鉴定正确的F0代动物性成熟后与同背景野生型动物配繁获得F1代，即为模拟人类帕金森病的动物模型。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于所述携带E46KA53T突变位点的人源SNCA基因蛋白质编码区序列如SEQ ID No:1所示。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于所述同源供体具有Thy1.2启动子。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于所述同源供体为Thy1基因敲除质粒，所述质粒保留了Thy1.2启动子，其原外显子2、3、4的编码区替换为携带E46KA53T突变位点的人源SNCA基因蛋白质编码区cDNA。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于所述同源供体携带E46KA53T突变位点的人源SNCA基因蛋白质编码区cDNA上游具有kozak序列。

10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于所述DNA同源供体序列如SEQ ID No:2所示。

11.根据权利要求1-10任一项所述的构建方法，其特征在于所述动物为哺乳动物。

12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于所述动物为啮齿类动物。

13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于所述动物为大鼠或小鼠。