[发明专利]一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系

说明书

本发明公开了一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系，属于生物技术领域。本发明提供的LagTag/LagCatcher是全新发现的、能够有效完全正交于其他现有Tag/Catcher的不可逆共价连接对(即与现有的Tag/Catcher对无交叉反应)。反应仅需将分别融合有LagTag和LagCathcer的分子混合即可自发进行。本发明提供的LagTag/LagCatcher增加了一锅反应底物的种类，减少固相延长蛋白链中链生长、纯化步骤的重复次数，进而用于各种蛋白质生物耦联的应用场景中，如多聚蛋白生产、活细胞蛋白标记、嵌合抗原疫苗制备等。

技术领域

本发明涉及一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系，属于生物技术领域。

背景技术

SARS-CoV-2属于巢病毒目冠状病毒科的一种单股正链RNA病毒，其具有变异快、宿主多及较强宿主适应性等特点。如今已出现包括Alpha、Beta、Delta、Omicron等在内的众多突变体，他们感染能力、致病性各有不同，类型众多的突变株为抗疫工作(疫苗、特效药研发等)带来巨大挑战，已接种疫苗的人群也并非完全安全，他们仍有感染新冠的风险。2022年6月23日刊登于Cell的一篇文章证实串接不同抗原的嵌合疫苗相比同抗原二聚体疫苗拥有更广泛的免疫保护能力[2]，这表明将不同受体结合结构域(RBD)共价串联是提高疫苗广谱性的有效方法之一，可使用何种方法能高效准确的将更多的疫苗抗原蛋白整合又是一大难题。

蛋白质生物耦联通常是利用天然氨基酸的化学性质(如氨基、羧基和巯基等)，通过催化共价化学键的形成而实现。近些年，通过形成异肽键(iso-peptide)而催化蛋白间共价连接的Tag/Catcher体系越来越引起人们的关注，其中研究最多且深入的既是SpyTag/SpyCatcher共价连接系统[3-4]。在蛋白质内部，各氨基酸之间通过α-氨基与α-羧基脱水缩合而形成的共价键称之为肽键，而由赖氨酸侧链上的氨基(-NH₂)与天冬酰胺的侧链氨基或天冬氨酸的侧链羧基(-COOH)间发生缩合反应，失去一个NH₃或一个H₂O分子而形成的共价键称之为异肽键，这一缩合反应通常是由邻近的谷氨酸催化而自发发生的。现有研究显示，在一些革兰氏阳性菌的菌毛蛋白和粘附蛋白中，这种自发形成的异肽键的存在极为普遍。而Tag/Catcher共价连接系统就是利用此类异肽键，对蛋白进行拆分后所开发形成的[5]。

目前比较成熟的Tag/Catcher系统主要有SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher两种。Spy系统采用的是酿脓链球菌纤连蛋白结合蛋白FbaB的CnaB2结构域，将CnaB2拆分为两部分，其一为N端含116个氨基酸残基的多肽(SpyCatcher，含第31位的赖氨酸和第77位的谷氨酸)，其二为C端含13个氨基酸残基的多肽(SpyTag，含第117位的天冬氨酸)[5]。而Snoop系统采用的是肺炎链球菌的菌毛粘附素RrgA，将RrgA的D4结构域拆分为N端含106个氨基酸残基的多肽(SnoopTag，含第742位的赖氨酸)和C端含12个氨基酸残基的多肽(SnoopCatcher，含第803位的谷氨酸、第854位的天冬酰胺)两部分[6]。

Tag与Catcher在溶液中，能够快速地形成不可逆的异肽键这一共价连接，因此，将分别融合了Tag和Catcher的两种蛋白组分混合在一起，二者即可被迅速地连接起来，且由于异肽键的形成不可逆，因此这种连接极度稳定。目前，这一共价连接体系已经在蛋白质改造等工程手段中得到了广泛的应用。比如，通过在蛋白质的N端和C端分别融合Tag和Catcher，使蛋白质自发成环，能够显著提高蛋白质的稳定性；将其与水凝胶中的多聚材料进行融合，使其携带特定蛋白，能够模仿特定的细胞微环境；利用该系统使抗原与纳米颗粒融合，实现抗原聚集，能够显著增强免疫效果；将其与荧光探针融合，被用于研究革兰氏阴性菌外膜上的致病因子，探究膜蛋白的形态、动力学等[3,6]。