[发明专利]水稻OsNPR1基因及其在抗水稻条纹叶枯病中的应用

权利要求书

1.OsNPR1基因在抗纤细病毒属病毒作物育种中的应用，所述基因序列如：SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的应用，编码所述OsNPR1基因的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1-2任一项所述的应用，所述纤细病毒属病毒(Tenuiviruses)包括稗草白叶病毒(Echinochloa hoja blanca virus，EHBV)、玉米条纹病毒(Maize stripe virus，MSpV)、水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus，RGSV)、水稻白叶病毒(Rice hojablanca virus，RHBV)、水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RSV)、尾粰草白叶病毒(Urochloa hoja blanca virus，UHBV)。

4.权利要求3所述的应用，所述作物优选水稻，玉米，小麦，燕麦和大麦；更优选水稻，最优选日本晴。

5.一种水稻条纹病毒(RSV)转基因水稻的制备方法，其步骤包括：

(1)构建水稻过表达OsNPR1载体

设计带有BamHI及SacI酶切位点的引物去扩增权利要求1所述的OsNPR1基因，用BamHI、SacI酶对pCV1300载体进行双酶切，酶切位点的引物，用于OsNPR1双元表达载体PCV1300的构建，引物序列如下：

PCV-OsNPR1-F:

GTTCCAGATTACGCTGGATCCATGGAGCCGCCGACCAGCCA

SEQ ID NO:5

PCV-OsNPR1-R:

ATCGGGGAAATTCGAGCTCTCATCTCCTTGGTCGAATGGC

SEQ ID NO:6

酶切PCV1300载体后，将上述引物扩增PCR产物分别与载体连接；挑选阳性克隆，进行测序确认已成功构建PCV1300-OsNPR1表达载体。

(2)EHA105农杆菌的培养与水稻愈伤组织诱导培养：取-80℃冰箱保存的含有序列如SEQ ID NO:1所示的目基因载体的质粒PCV1300-OsNPR1转化根瘤农杆菌EHA105；详细的操作步骤如下，首先吸取1μL质粒加到100μL感受态细胞中，吹打混匀，加入4℃提前遇冷的电极杯中，2200V的电压转化，加入500μL无抗性的LB液体培养基，28℃，200rpm培养2-3h，涂布于含有50μg/ml Kan及Rif平板上，28℃培养箱培养3d；随后将成熟的水稻种子，去壳，用75％的酒精浸泡10min，无菌水清洗3遍；30％的次氯酸钠溶液，浸泡30min；用无菌水清洗后再浸泡30min；用灭菌的镊子将种子放入成熟胚诱导培养基中，28℃光照培养箱，培养3周，将长出的愈伤组织用灭菌的镊子转移到继代培养基中，28℃光照培养箱继代培养1周；

(3)农杆菌转染愈伤组织：挑EHA105的单克隆接种到LB液体培养基中，OD₆₀₀＝0.6；收集菌体，用AS的农杆菌悬浮培养液重新悬浮菌，OD₆₀₀＝0.1；将诱导好的愈伤组织加入到农杆菌悬浮培养液中浸泡5min；将愈伤组织取出，放入共培养基中，25℃光照培养箱培养2.5d；

(4)抗性愈伤的筛选与培养：将愈伤组织放在含有潮霉素B的培养基上，30-45d后进行筛选，筛选得到的愈伤组织放入生根培养基中培养，等到产生带根的绿色植株，培养2周，获得转基因水稻。

6.权利要求5所述的制备方法，所述诱导培养基包含：N6培养基24.1g/L、2.5mg/L 2,4-D、PH＝5.8。

7.权利要求5所述的制备方法，所述继代培养基包含：N6培养基24.1g/L、2.5mg/L 2,4-D、50mg/L潮霉素、300mg/mL头孢霉素、PH＝5.8。

8.权利要求5所述的制备方法，所述生根培养基包含：1/2MS 39.45g/L、0.5mg/L NAA、50mg/L潮霉素、PH＝5.8。