[发明专利]一种重组杆状病毒及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种重组杆状病毒及其构建方法和应用，所述重组杆状病毒为将gp64supgt;TM/supgt; supgt;double/supgt;‑egfp基因通过转座重组整合到杆状病毒－苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV(Autographa californica nucleopolyhedrovirus)的基因组上获得的。本发明还提供了重组杆状病毒的构建方法，包括从AcMNPV基因组获得gp64基因，并对gp64基因中编码跨膜结构域(transmembrane domain,TM)的序列加倍后获得gp64supgt;TM/supgt; supgt;double/supgt;，将gp64supgt;TM/supgt; supgt;double/supgt;重组到pFastBacDual‑egfp，通过Bac‑to‑Bac系统获得重组杆状病毒AcMNPV‑gp64supgt;TM/supgt; supgt;double/supgt;‑egfp，AcMNPV‑gp64supgt;TM/supgt; supgt;double/supgt;‑egfp病毒较AcMNPV‑egfp相比，在宿主细胞中的增殖能力显著提高，并可减少对草地贪夜蛾幼虫的半致死时间。本发明的重组杆状病毒在制备防治草地贪夜蛾幼虫的微生物杀虫剂方面具有应用前景。

技术领域

本发明涉及重组病毒，具体属于一种重组杆状病毒及其构建方法，该重组病毒增殖能力强，可用于制备防治草地贪夜蛾幼虫的微生物杀虫剂。

技术背景

杆状病毒杀虫剂作为农作物、森林害虫防治的新型安全的生物农药，现今已经越来越受到人们的重视。相较于传统的化学农药来说，杆状病毒对于宿主昆虫具有高度的病原性，对于其它非靶标生物十分安全，能够在环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物无害，不污染环境，能和其他化学农药混合使用，同时具有防效时间长、使用方便等优点。因此，早在1973年，就被联合国粮农组织推荐作为化学农药的理想替代品。

但是，杆状病毒杀虫剂也有一定的缺点。在一定程度上，杆状病毒杀虫剂毒性小、增殖缓慢、见效慢。病毒在进入虫体后，要经历一段时间后才大量增殖而使害虫致死，一般需要7～14天。要在短期内快速杀虫的要求下无法满足杀虫需求。所以，提高杆状病毒在宿主害虫的增殖速度从而提高其抗虫活性已成为当今研发杆状病毒生物杀虫剂的发展方向。

由于杆状病毒基因组较大，不能直接对其进行操作插入外源基因，因此需要通过中间载体获得重组杆状病毒。GP64是杆状病毒出芽型病毒粒子(BV)囊膜上一种主要的糖蛋白。有研究表明，GP64上的跨膜结构域(transmembrane domain,TM)是决定GP64膜融合功能的关键，因此，本发明在gp64基因中扩增了一个TM结构域的序列，获得gp64^TM double基因，构建了重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体杆状病毒AcMNPV-gp64^TM double-egfp。实验证明，该重组病毒可显著提高在宿主细胞中的增殖率，并减少对草地贪夜蛾幼虫的半致死时间，因此，可单独或联合其它抗虫或外源基因构建高效的重组杆状病毒杀虫剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒可以通过在感染草地贪夜蛾Sf9细胞后提升病毒的增殖率。

本发明的目的还在于提供一种该重组杆状病毒的构建方法，包括获得重组杆状病毒的中间载体的构建方法。

为实现本发明的上述目的，可以通过如下技术方案实现：

本发明提供的一种重组杆状病毒，该重组病毒为将序列为SEQ ID No.1所示的基因通过Bac-to-Bac转座重组系统整合到AcMNPV基因组中获得。该基因序列为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV的gp64^TM double基因和水母增强型绿色荧光蛋白egfp基因的串联基因。

该重组杆状病毒可以在被感染的Sf9宿主细胞中表达融合蛋白GP64^TM double-EGFP。