[发明专利]永生化角质形成细胞的建立及其应用

说明书

本发明公开了一种永生化角质形成细胞的建立及其应用。所述永生化角质形成细胞的建立包括原代角质细胞的提取、慢病毒的包装和慢病毒感染原代角质细胞三个步骤。采用本发明所构建的永生化角质形成细胞，可用于制造三维培养表皮模型，所得到的模型没有作为原料的细胞株的批次之间的偏差问题，并保持稳定的质量。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种永生化角质形成细胞的建立及其应用。

背景技术

皮肤大致分为表皮、真皮、皮下组织三层结构。皮肤中，存在于最外层的表皮主要由角质细胞(表皮角化细胞)构成，还包括产生黑色素的黑素细胞、抗原呈递细胞即朗格汉斯细胞、与触觉有关的默克尔细胞等。角质细胞，表皮的最下层的基底层分裂，随着成熟向上方的层转移，角化不久脱落(角质化)。因此，表皮由成熟阶段的不同角质细胞组成的多个层(基底层、棘层、颗粒层、角质层)构成。角质形成细胞的干细胞存在于基底层，并根据需要重复增殖和分化，不断向表皮供应新细胞，从而使皮肤不断地增加，重复再生。

近年来，从爱护动物的观点出发，不进行动物实验而进行化妆品和医药品原料的安全性和有效性的评价试验的动物实验替代法备受关注。三维培养表皮模型是在人体外人为模仿皮肤表皮组织制作的组织模型，在化妆品和医药品开发中不使用实验动物，是评价药物对皮肤的有效性和刺激性，或在进行皮肤科学研究方面有用的代表性动物实验替代法的工具。到目前为止，开发了各种各样的三维培养表皮模型，并在市场上销售，但由于它们大多是使用从供体采集的初代培养的角质细胞作为原料制造的，因此，由于供体的个体差异引起的性状不同，难以制作具有稳定的相同性状的表皮模型。另外，原代培养细胞一般与永生化细胞相比增殖慢，如果继续培养，则难以维持正常的角化能力降低等培养。同时，即使是来源相同的细胞，由干伴随继代培养的细胞老化，所制作的培养表皮的品质也会显著恶化，在用于皮肤刺激性试验等的情况下，也存在评价结果不一致的问题。到目前为止，作为研究用工具，已知为了制作以稳定化、标准化为目标的培养表皮，角质细胞的永生化是有效的，例如，使用HaCaT和PAM121等自然永生化细胞株。但是，自然永生化细胞大多不具有正常的分化性状，表皮向各层的分化能力低或缺失，在培养表皮的形成中还不能令人满意。

发明内容

本发明的目的是提供一种永生化角质形成细胞的建立及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种永生化角质形成细胞的建立方法，包括以下步骤：

步骤1，原代角质细胞的提取，从包皮环切术中获得的健康儿童包皮组织，去除皮下脂肪组织后提取表皮，表皮经消化处理后置于含双抗的人原代角质细胞培养基进行培养，之后将细胞进行消化传代，得到原代角质细胞；

步骤2，慢病毒的包装，将hTERT、CDK4、BIM-1三种质粒使用HG Transgene ^TMReagent进行共转染293T细胞，制备包装hTERT、CDK4、BIM-1三种质粒的病毒颗粒；

步骤3，慢病毒感染原代角质细胞，将步骤2得到的病毒颗粒加至步骤1得到的原代角质细胞培养基中，进行培养后得到永生化角质形成细胞。

进一步地，步骤1中，所述提取表皮是将去除皮下脂肪组织后的包皮组织放入含Dispase II的消化液中浸泡。更进一步地，Dispase II的浓度为0.5％，浸泡条件为4℃。

进一步地，步骤1中所述消化处理是先将表皮剪碎后置于含胰酶的EDTA消化液中进行消化，然后加入10％ FBS-DMEM培养基中和胰酶，经离心后取上清。更进一步地，消化条件为37℃、时间为10min。

采用上述方法得到的永生化角质形成细胞。

上述永生化角质形成细胞在制备三维表皮模型中的应用。

进一步地，所述应用的具体过程为：