[发明专利]永生化角质形成细胞的建立及其应用

权利要求书

1.一种永生化角质形成细胞的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，原代角质细胞的提取，从包皮环切术中获得的健康儿童包皮组织，去除皮下脂肪组织后提取表皮，表皮经消化处理后置于含双抗的人原代角质细胞培养基进行培养，之后将细胞进行消化传代，得到原代角质细胞；

步骤2，慢病毒的包装，将hTERT、CDK4、BIM-1三种质粒使用转染试剂进行共转染293T细胞，制备包装hTERT、CDK4、BIM-1三种质粒的病毒颗粒；

步骤3，慢病毒感染原代角质细胞，将步骤2得到的病毒颗粒加至步骤1得到的原代角质细胞培养基中，进行培养后得到永生化角质形成细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中，所述提取表皮是将去除皮下脂肪组织后的包皮组织放入含Dispase II的消化液中浸泡。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：Dispase II的浓度为0.5％，浸泡条件为4℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中，所述消化处理是先将表皮剪碎后置于含胰酶的EDTA消化液中进行消化，然后加入10％FBS-DMEM培养基中和胰酶，经离心后取上清。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：消化条件为37℃、时间为10min。

6.采用权利要求1-5任一项所述的方法得到的永生化角质形成细胞。

7.权利要求6所述的永生化角质形成细胞在制备三维表皮模型中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：

步骤1，将DMEM培养基、EpiLife^TM培养基按体积比1：9混合，然后加入浓度为1～4.5mg/mL大鼠尾部胶原I，作为胶原蛋白混合物，用氢氧化钠溶液调节其pH，直到混合物变为粉红色或红色；

步骤2，将胶原蛋白混合物倒入Transwell小室中进行孵育，待胶原蛋白混合物凝胶形成后，向Transwell小室中加入培养液，将永生化角质形成细胞接种在胶原蛋白混合物凝胶上，培养基每天都在更换，2-3天后，将分化培养基放于Transwell小室下方，并将Transwell小室提至气液面，气液面分化8-14d，得到三维表皮模型。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述培养液的组成为：含4.5mg/mL葡萄糖的DMEM和Ham's F-12按体积比3：1混合，加入5mg/mL胰岛素、10ng/mL EGF、0.4mg/mL氢化可的松、2×10^-11M 3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸、5mg/mL转铁蛋白、10M霍乱毒素、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和10％胎牛血清。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述分化培养基是向培养液中加入1.5mMCa²⁺和50μg/mL抗坏血酸后得到。