[发明专利]小花山柰提取物的制备方法及其应用

权利要求书

1.小花山柰提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.小花山柰根状茎提取物的制备，制备步骤如下：

S1-1：称取500g洗净晾干的小花山柰根状茎，将其粉碎后放入1000ml玻璃容器内；

S1-2：向玻璃容器内加入800ml甲醇，在室温下冷浸提取7d后过滤，并使用旋转蒸发仪浓缩过滤液，重复提取3-5次浓缩得到小花山柰根状茎甲醇提取物；

S1-3：向浓缩后的甲醇提取物内加入500ml水，将甲醇提取物与水混匀，混匀后用等体积的石油醚萃取3-5次，萃取完全后，再用等体积的乙酸乙酯萃取，最后用等体积的正丁醇萃取，分别浓缩萃取液即得石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层提取物，4℃冷藏备用；

S2.小花山柰根状茎提取物抗细菌活性的测定；

S3.小花山柰根状茎提取物抗真菌活性的测定；

S4.小花山柰根状茎提取物的细胞毒性测定；

S5.小花山柰根状茎提取物的高效液相色谱分析。

2.根据权利要求1所述的小花山柰提取物的制备方法，其特征在于：S2中，小花山柰根状茎提取物抗细菌活性的测定步骤如下：

S2-1.在28℃，黑暗条件下，用LB平板对供试细菌进行活化培养48h，并挑取单菌落；

S2-2.在28℃，150rpm，黑暗条件下，用LB液体培养基摇培24h，将菌液浓度稀释到10⁸cfu·mL^-1备用；

S2-3.用移液枪吸取50μL菌液，用玻璃棒对菌液进行涂板；

S2-4.用灭完菌的打孔器在涂有细菌的培养基平板上均匀打出直径为6mm的三个孔，在每个孔中分别加入40μL的供试细菌，在黑暗条件下培养24h后，用尺子测量抑菌圈大小，其中，阳性对照为5μL，0.2mg·mL^-1的硫酸链霉素，每个处理重复3次；其中，供试细菌包括桉树青枯病菌、根癌农杆菌、番茄疮痂病菌、黄瓜角斑病菌、溶血葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。

3.根据权利要求2所述的小花山柰提取物的制备方法，其特征在于：S3中，小花山柰根状茎提取物抗真菌活性的测定步骤如下：

S3-1:称取三种不同的杀菌剂各240mg，分别向杀菌剂中加入0.3mL的DMSO，待杀菌剂与DMSO完全溶解后加入0.7mL的无菌水；

S3-2:采用倍半稀释法，将30％的DMSO再次加入到杀菌剂中，将杀菌剂依次稀释成8个不同的浓度；

S3-3:将配制好的8个不同浓度的杀菌剂各取1mL分别加到29mL的PDA中，充分混匀后倒入3个无菌培养皿中，每皿为10mL，得到杀菌剂终浓度分别为8mg/mL、6mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL和0.125mg/mL的含药培养基，且每浓度梯度3个平行；

S3-4:将配制好的8个不同浓度的杀菌剂分别取1mL加到29mL的PDA中，充分混匀后倒入3个无菌的培养皿中，每皿为10mL，得到杀菌剂的终浓度分别为0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL和0.00625mg/mL的含药培养基；

S3-5:用打孔器将培养5d且生长良好的供试真菌沿其边缘打成直径为7mm的菌饼，菌饼朝下接种在含药PDA平板上；将加入无菌水的PDA平板作为空白对照，将加入30％DMSO的PDA平板作为阴性对照，将加入98.4％多菌灵的PDA平板作为阳性对照，每个处理重复3次；

S3-6:将配置好的培养基置于28℃温度下培养5d，待空白对照组的菌落生长至占培养皿面积的2/3时，采用十字交叉法测得不同处理情况下的菌落直径并计算抑菌率；抑菌率的计算公式如下：

其中，供试真菌包括杜英生假隐丛赤壳和油茶炭疽病菌。