[发明专利]一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法及其应用

说明书

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法及其应用。本发明通过采用施加脂多糖(或脂多糖联合脂联素)的方式并对诱导条件进行筛选优化，从而成功诱导心肌细胞转化为心肌炎症细胞，同时采用差速离心法和超滤法相结合的方式提取细胞培养上清中的外泌体，得到的外泌体提取物具有产量大，纯度高等优点。同时上述技术方案通过优化的脂联素添加浓度和添加时间进一步培养心肌细胞及心肌炎症细胞，使得外泌体的产量和纯度可以获得明显的提高。从而方便后续外泌体内容物以及功能研究的进行，并提供相应的外泌体鉴定方法，为后续研究外泌体在心肌炎症中的作用机制提供方法学基础，因此具有良好的实际应用之价值。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

外泌体是一种由活细胞产生的直径40-160nm，具有脂质双层膜结构的细胞外囊泡，可广泛存在于多种体液及细胞培养上清中。外泌体内含有核酸、蛋白质及脂质等多种生物活性物质，在细胞间通讯中发挥重要作用。已有研究表明，在多种疾病的病理生理过程中，外泌体的含量及其内容物会有所变化，以促进或抑制疾病进展。近年来，随着对外泌体研究的不断深入，外泌体在动脉粥样硬化、急性心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病中的抗炎、改善心室重构、促进血管新生等作用受到越来越多学者的重视。

心肌炎是由多种病因引起的可危及生命的心肌炎症，可导致心功能障碍以及心律失常等严重后果，但目前心肌炎的发病机制尚不明确，外泌体在心肌炎中是否发挥作用、怎样发挥作用都有待研究。

合适的外泌体提取等纯化方式，对后续其内容物分析及功能研究起到重要的作用，已有学者对内皮细胞、心脏祖细胞等心血管细胞外泌体的收集纯化方式进行研究，但发明人发现，对人心肌细胞以及心肌炎症细胞来源的外泌体的提取及纯化方式尚未见报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法及其应用。本发明通过脂多糖诱导产生心肌炎症细胞，采用差速离心法和超滤法相结合的方式提取细胞培养上清中的外泌体，为后续研究外泌体在心肌炎症中的作用机制提供方法学基础。基于上述研究成果，从而完成本发明。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法，所述方法包括：

S1、培养心肌细胞并诱导产生心肌炎症细胞；

S2、诱导成功心肌炎症细胞继续培养并收集培养基，离心，得上清液I；

S3、将步骤S2获得的上清液I进行高速离心，收集得上清液II；

S4、将S3中收集的上清液II经滤器过滤至超速离心管中，超速离心，离心后所得沉淀即为外泌体。

本发明中采用差速离心法和超滤法相结合的方式提取细胞培养上清中的外泌体，所得外泌体纯度高，杂质少，方便后续外泌体内容物以及功能研究的进行。

此外，需要说明的是，上述提取方法中虽然以脂多糖诱导获得的心肌炎症细胞为例，对外泌体细胞提取进行了具体描述，但是上述提取方法对提取正常心肌细胞的外泌体同样适用，区别仅在于没有使用脂多糖诱导获得的心肌炎症细胞的步骤。

本发明的第二个方面，提供上述心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体的提取方法提取制得的外泌体。

本发明的第三个方面，提供上述外泌体在心血管相关疾病基础研究和临床诊治中的应用。

与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：