[发明专利]一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法及其应用

权利要求书

1.一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、培养心肌细胞并诱导产生心肌炎症细胞；其中，诱导产生心肌炎症细胞的方法包括加入10-20μg/ml脂多糖培养24-48h诱导产生心肌炎症细胞；并在脂多糖加入后的0-8小时加入10-25ng/ml的脂联素；

S2、诱导成功心肌炎症细胞继续培养并收集培养基，离心，得上清液I；

S3、将步骤S2获得的上清液I进行高速离心，收集得上清液II；

S4、将S3中收集的上清液II经滤器过滤至超速离心管中，超速离心，离心后所得沉淀即为外泌体。

2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述心肌细胞为AC16心肌细胞。

3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤S1具体方法包括：培养心肌细胞的具体方法包括：选用含有10％胎牛血清的完全培养基对心肌细胞进行培养，其培养条件为：30-40℃，3-8％CO₂，当细胞生长密度达50％时，更换无血清的培养基继续培养8-12小时，加入10-20μg/ml脂多糖培养24-48h诱导产生心肌炎症细胞；并在脂多糖加入后的4-6小时加入10-25ng/ml的脂联素。

4.如权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述胎牛血清为去除外泌体的胎牛血清。

5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤S2中，具体离心方法包括：将收集到的培养基在低温200-500g离心5-20min，从而用于去除培养基中的悬浮细胞，然后在低温1500-2500g离心5-20，去除死细胞，收取获得上清液I。

6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤S3中，具体高速离心方法包括：在低温8000-10000g离心20-50分钟。

7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤S4具体方法包括：将收集到的上清液II经0.22μm滤膜过滤至超速离心管中，去除上清中直径大于0.22μm的大分子物质，将滤液于低温90000-120000g超速离心60-80min，弃去上清液，留0.5-1mL液体，吹打混匀后，将多个离心管内液体收集于同一离心管内，以便对相同来源的外泌体进行富集，在低温90000-120000g再次超速离心60-80min，所得沉淀即为外泌体。

8.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述提取方法还包括对获得心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体进行鉴定的步骤，所述鉴定的步骤包括但不限于采用透射电镜对所提取外泌体的形态进行评估、采用Western blot对外泌体表面标志蛋白CD63、TSG101进行验证以及采用纳米颗粒跟踪分析技术对所得外泌体大小以及数量进行评估。

9.权利要求1-8任一项所述方法对心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体的提取方法提取制得的外泌体。

10.权利要求9所述外泌体在心血管相关疾病基础研究和临床诊治中的应用。