[发明专利]用于蛋白质聚乙二醇化的添加剂体系

说明书

本公开提供了用于蛋白质聚乙二醇化的添加剂体系。所述添加剂体系包含单独使用或与芳族胺如3,5‑二氨基苯甲酸或与铵盐如氯化铵或乙酸铵组合使用的对氨基苯甲酰肼。所公开的添加剂组合提供了几个益处，包括增加的反应速率，更高的产率和完成缀合反应所需的氨氧基‑PEG当量的减少。典型的反应可以通过将添加剂或添加剂体系与蛋白质溶液和氨氧基‑PEG试剂混合来进行。将溶液调节至pH4并保持在20‑25℃而不搅拌直至完成，通常在24小时内完成。

本申请是申请日为2016年11月22日，申请号为201680067897.7，名称为“用于蛋白质聚乙二醇化的添加剂体系”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2015年11月23日提交的临时专利申请62/258644的权益，其教导通过引用明确地并入本文。

技术领域

本公开涉及用于蛋白质聚乙二醇化反应的改进的添加剂体系。具体而言，本公开鉴定了用于含有对乙酰基苯丙氨酸残基的蛋白质和氨氧基-PEG化合物之间的缀合反应的添加剂。

背景蛋白质的聚乙二醇化是一种缀合过程，其涉及聚乙二醇衍生物与治疗性蛋白质的连接以通过降低清除率并提供空间庇护使免遭蛋白水解酶和免疫系统识别来提高其稳定性和药代动力学(Robens，M.J.等人，Adv.Drug Delivery Rev，54：459(2002))。通常，聚乙二醇化技术可以分为两种类型，即随机和位点特异性缀合。随机聚乙二醇化任意地将聚乙二醇化试剂与反应性氨基酸如赖氨酸或半胱氨酸连接以提供聚乙二醇化产物的混合物。相反，位点特异性缀合利用天然官能团(例如N-或C-端基团)或非大然氨基酸(例如对乙酰基苯丙氨酸-pAcF)的明确反应性来控制连接在蛋白质上的PEG残基的位置和数目。涉及聚乙二醇化试剂与pAcF残基之间的酮肟形成的位点特异性缀合反应通过遗传密码的扩充被掺入底物蛋白质中(Liu，C.C.等人，Annu.Rev.Biochem.，79：413(2010)；Tian，F等人，″Accelerants for the modification of non-natural amino acids and non-naturalamino acid polypeptides，美围专利号7,468,458(2008年12月23日))。尽管它们具有已证实的效用，但基于酮肟形成的缀合因速率慢和转化不完全而受到损害(Crisalli，P.等人，J.Org.Chem.，78：1184(2013))。改善酮肟形成的尝试包括使用过量的聚乙二醇化试剂，高温或高浓度的毒性催化剂。然而，这些解决方案引入了额外的步骤以从产物中除掉过量的聚乙二醇化试剂或毒性催化剂并且经常损害蛋白质的稳定性。此外，旧方法不使用添加剂，使用变性剂(脲)，和/或使用乙酰肼(AcNHNH₂)作为添加剂。AcNHNH₂和相关结构已经在PCT公开号WO 2007/056448中进行了限定。

本领域现在需要通过检查影响失速的机械原理和通过鉴定加速反应并促进在低PEG：蛋白质摩尔比下的高转化率的新添加剂来提高含有pAcF残基的蛋白质(松弛素和FGF21)的聚乙二醇化的产率和速率的新方法。该方法应该是经济的，促进在非常低量的聚乙二醇化试剂下的较高转化率，促进更快的反应，其避免了需要高反应温度和除掉遗传毒性物质。

概述

在第一个实施方案中，本公开提供用于蛋白质聚乙二醇化反应的改进的添加剂体系，所述体系包含单独的对氨基苯甲酰肼或与芳族胺或铵盐组合的对氨基苯甲酰肼。

在另一个实施方案中，本公开提供了用于获得聚乙二醇化蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：鉴定蛋白质、PEG试剂和添加剂体系；和溶解蛋白质，然后在添加剂体系存在下将所述蛋白质与PEG试剂混合，从而以高产率获得聚乙二醇化蛋白质。

在另一个实施方案中，本公开提供了包含通过上述实施方案中提及的方法获得的聚乙二醇化蛋白质的药物组合物，其用于需要其的个体的治疗。

附图简述

图1：形成酮肟的一般机制。