[发明专利]一种基于EMS诱变的蒲公英耐盐突变体筛选的方法

权利要求书

1.一种基于EMS诱变的蒲公英耐盐突变体筛选的方法，其特征在于；包括以下步骤：

步骤S1：清洗蒲公英，以蒲公英叶片为试材，将蒲公英叶片进行清洗，最后用手术刀将蒲公英叶片切成1cm x1cm左右见方的小块；

将蒲公英叶片放在含不同浓度的植物生长调节剂MS培养基中诱导愈伤组织，试验均为（25 ± 1）℃暗培养30d；

步骤S2：愈伤组织处理，将步骤S1中的愈伤组织试材浸泡在0.15%EMS处理液中；

步骤S3：当步骤S2中的愈伤组织处理完毕后，将愈伤组织接种于继代培养基上恢复生长15～20d，促进其生长；

步骤S4：将步骤S3中将恢复生长后的愈伤组织进行Nacl逐步筛选，3次重复；

步骤S5：将步骤4中的愈伤组织在最大耐受体积浓度1.2%的Nacl的培养基中培养筛选10-15d。

2.根据权利要求1所述的一种基于EMS诱变的蒲公英耐盐突变体筛选的方法，其特征在于：步骤S1中，蒲公英的清洗方法如下：用流水冲洗1 min清除叶片表面污渍；

在超净工作台中用75%的乙醇冲洗15s；

用无菌超纯水冲洗3次后，用0.1%的氯化汞消毒8-10min，接着用无菌超纯水冲洗5次。

3.根据权利要求1所述的一种基于EMS诱变的蒲公英耐盐突变体筛选的方法，其特征在于：步骤S2中，愈伤组织试材在处理期间放入摇床100r/min、 25 ℃黑暗环境条件，使溶液与愈伤组织均匀接触，处理时间为8h。

4.根据权利要求1所述的一种基于EMS诱变的蒲公英耐盐突变体筛选的方法，其特征在于：步骤S3中采用继代培养基为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+0.5mg/L+Nacl1%。

5.根据权利要求1所述的一种基于EMS诱变的蒲公英耐盐突变体筛选的方法，其特征在于：步骤S4中，Nacl筛选采用多步筛选法，将EMS诱变处理后新增殖的愈伤组织依次转入含不同浓度的Nacl选择培养基上培养15d，以未经EMS处理的愈伤组织作为对照；筛选出蒲公英对Nacl的最大耐受浓度为1.2%，即为选择压。

6.根据权利要求1所述的一种基于EMS诱变的蒲公英耐盐突变体筛选的方法，其特征在于：步骤S1的诱导培养基为MS+0.08mg/L 6-BA+0.3mg/L2,4-D。

7.根据权利要求1所述的一种基于EMS诱变的蒲公英耐盐突变体筛选的方法，其特征在于：步骤S3中，愈伤组织的处理方式为将愈伤组织用无菌水冲洗5次以上，去除毒性，吸干表面水份。

8.根据权利要求1所述的一种基于EMS诱变的蒲公英耐盐突变体筛选的方法，其特征在于：步骤S5中，将筛选之后的愈伤组织进行筛选，存活的愈伤组织继续接入含有体积浓度1.2%的Nacl选择培养基中培养10-15d；再将存活的材料转入不含Nacl的培养基中培养10-15d。