[发明专利]一种柑橘原生质体裂解液及其应用、柑橘果肉液泡的提取方法

说明书

本发明属于植物细胞液泡提取技术领域，具体涉及一种柑橘原生质体裂解液及其应用、柑橘果肉液泡的提取方法。本发明柑橘原生质体裂解液包括0.2～0.8M甘露醇，10wt.％Ficoll，10～20mMEDTA，1～5mMDTT和10～20mMpH缓冲液；所述柑橘原生质体裂解液的pH为7.8～8.5。本发明通过精心调配柑橘原生质体裂解液，可以更好地破碎柑橘原生质体，使柑橘液泡游离出来，保持液泡的生理状态，增大柑橘液泡的提取数量和提取效率。

技术领域

本发明属于植物细胞液泡提取技术领域，具体涉及一种柑橘原生质体裂解液及其应用、柑橘果肉液泡的提取方法。

背景技术

植物细胞中的液泡膜具有特殊的选择透过性，使液泡具有高渗性质，引起水分向液泡内运动，对调节细胞渗透压、维持膨压有很大关系，并且能使多种物质在液泡内贮存和积累。

柑橘果实的糖分积累主要来源是叶片和果皮的光合作用，通过橘络也就是瓤上的白色维管束和囊衣传输积累到果实液泡中。成熟柑橘90％以上被液泡占据，液泡也是柑橘糖分的主要储存区。

液泡提取的方法一般包括裂解细胞提取原生质体，再裂解原生质体提取液泡。由于不同植物细胞的细胞结构有差异，且液泡的膜结构极易受外界环境影响而破裂，因此提取液泡的方法和提取效果也不尽相同。例如现有技术(Ma,J.F.,etal.,SubcellularlocalisationofCdandZnintheleavesofaCd-hyperaccumulating ecotypeofThlaspicaerulescens.Planta,2005.220(5):731-736)公开了遏蓝菜叶片的液泡的提取，在液泡纯化过程中，先将粗提液泡重悬于浓度较大的聚蔗糖溶液中，再在该重悬液的上层加一层浓度较小的聚蔗糖溶液进行密度梯度离心，提取液泡的效率较低，甚至无法得到完整、纯度较高的液泡；还如中国专利CN 103589678A公开了一种提取景天科植物细胞液泡的方法，但由于花粉材料的特殊性，该方法在叶片原生质体的提取过程中采用的方法完全不适合梨花粉管，采用其方法几乎不能获得花粉管原生质体。在梨花粉管液泡的纯化过程中，采用其方法在10％Ficoll表面发现较少的液泡和较多的花粉粒，可能由于材料的差异和离心速度不够导致分离纯化不完全。目前现有技术中并未有关于如何提取柑橘液泡的记载。

发明内容

本发明的目的在于提供一种柑橘原生质体裂解液及其应用、柑橘果肉液泡的提取方法，简便有效地从柑橘中提取到完整且纯度较高的液泡。

本发明提供了一种柑橘原生质体裂解液，包括以下含量的组分：0.2～0.8M甘露醇，10wt.％Ficoll，10～20mMEDTA，1～5mMDTT和10～20mMpH缓冲液；

所述柑橘原生质体裂解液的pH为7.8～8.5。

优选的，所述pH缓冲液包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。

本发明还提供了上述技术方案所述的柑橘原生质体裂解液在柑橘液泡提取中的应用。

本发明还提供了一种柑橘液泡的提取方法，包括如下步骤：

将上述技术方案所述的柑橘原生质体裂解液预热至37～42℃，得到预热裂解液；

将柑橘原生质体与所述预热裂解液按照1：(2～3)的体积比混合，裂解后静置，得到粗提液；所述粗提液中含有所述柑橘液泡。

优选的，所述裂解的时间为2～4min。

优选的，所述裂解的方式包括搅拌或吸打。

优选的，所述静置的时间为6～10min。

优选的，还包括对所述粗提液进行纯化；所述纯化包括如下步骤：

依次向所述粗提液中加入Ficoll质量体积百分含量为8％的Ficoll溶液和液泡溶液，4℃，50～3000g离心2～20min，得离心液；