[发明专利]一种合成使赤拟谷盗对磷化氢敏感的dsRNA的引物对及合成方法和应用

说明书

本发明提供了一种合成使赤拟谷盗对磷化氢敏感的dsRNA的引物对及合成方法和应用，涉及农业害虫防治技术领域。本发明所述引物对，可将RNA反转录得到的cDNA经PCR扩增后，再合成为dsRNA，将所述dsRNA经显微注射后，可构建得到赤拟谷盗磷化氢敏感种群，具备方法便捷、可靠特点。经实施例验证，本发明所述构建赤拟谷盗磷化氢敏感种群的方法，可将极高抗磷化氢的赤拟谷盗转变为敏感种群，方法可靠，效果稳定，为深入研究储粮害虫生长发育，明确储粮害虫抗药性水平，以开发效防治手段等应用，提供了可靠的赤拟谷盗磷化氢敏感种群。

技术领域

本发明属于农业害虫防治技术领域，具体涉及一种合成使赤拟谷盗对磷化氢敏感的dsRNA的引物对及合成方法和应用。

背景技术

储粮害虫是造成粮食数量和质量损失的重要生物因素之一。粮食仓储稳定环境和食物充足为储粮害虫的生长繁殖提供理想温床。对储粮害虫的防治方法包含物理防治、化学防治、生物防治和生态防治，其中以磷化氢熏蒸的化学防治最为普遍。但是，由于长期以来对磷化氢熏蒸剂的不合理且单一的使用，使得储粮害虫对其产生了较为严重的抗药性。

赤拟谷盗，英文名称为Red flour beetle，拉丁学名为Tribolium castaneum(Herbst)，属于鞘翅目(Coleoptera)，拟步甲科(Tenebrionidae)，拟谷盗属(Tribolium)。赤拟谷盗因其具有食性杂、多群居、危害周期长、分泌臭液、繁殖能力强等特点，对全球原粮和成品粮的储藏带来了极大的质量和数量损失。同时，赤拟谷盗还是一种科学研究中的模式昆虫。然而，磷化氢抗性给该模式昆虫的敏感品系建立带来极大挑战。为了深入研究储粮害虫生长发育，明确储粮害虫抗药性水平，以开发效防治手段，建立可靠的赤拟谷盗磷化氢敏感种群是解决以上瓶颈的关键。但是，现有技术中，缺乏可靠的构建赤拟谷盗磷化氢敏感种群的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种合成使赤拟谷盗对磷化氢敏感的dsRNA的引物对及合成方法和应用，所述dsRNA可稳定并可靠的构建对磷化氢敏感的种群。

本发明提供了一种合成使赤拟谷盗对磷化氢敏感的dsRNA的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种合成使赤拟谷盗对磷化氢敏感的dsRNA的方法，包括以下步骤：将赤拟谷盗的总RNA反转录为cDNA，以所述cDNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物合成为所述dsRNA。

优选的，所述PCR扩增的体系以25μL计，包括：模板1μL、上游引物和下游引物各0.5μL、TaKaRa Taq^TMPCR MasterMix 12.5μL和余量的无RNA酶水。

优选的，所述PCR扩增的程序，包括：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，40循环；72℃再延伸10min。

本发明还提供了利用上述方法合成的使赤拟谷盗对磷化氢敏感的dsRNA。

本发明还提供了上述引物对或上述dsRNA在构建赤拟谷盗磷化氢敏感种群中的应用。

本发明还提供了一种构建赤拟谷盗磷化氢敏感种群的方法，包括以下步骤：向赤拟谷盗的蛹中显微注射上述dsRNA。

优选的，将dsRNA显微注射至腹部第三和第四节腹节之间。

优选的，所述dsRNA的注射剂量为50～1000ng/只昆虫。