[发明专利]高通量筛选微生物菌株的方法

说明书

本发明涉及生物工程技术，公开了一种高通量筛选微生物菌株的方法。该方法包括：（1）建立微生物突变体库，构建微流控芯片；（2）利用微流控芯片对所述微生物突变体库中的菌株进行包埋形成液滴，其中，所述液滴的外相为含有表面活性剂的氟化油、内相为所述微生物突变体库菌株的培养液与水凝胶的混合物，所述内相的相变温度为所述微生物的生长温度；（3）将所述液滴进行液滴培养后固化形成微球，对所述微球进行微流控分选。该方法能够保持微生物的生长形状，增强液滴形貌，有效避免微球破裂，便于对微球进行准确筛选获得所需的微生物菌株。

技术领域

本发明涉及生物工程技术，具体涉及一种高通量筛选微生物菌株的方法。

背景技术

赤霉素是一种天然的植物生长调节剂，在植物的生长过程中起着至关重要的作用，不仅可以促进植物的生长，而且对干旱、盐害等恶劣环境具有明显的缓解作用。丝状真菌藤仓赤霉菌是一种高产赤霉素的主要工业菌株，如果想要实现高产赤霉素，需要对藤仓赤霉菌进行定向进化改造，通常采用随机诱变方法形成大量突变体文库，再对文库进行高通量筛选以获得高产赤霉素的理想菌株。目前已建立一批利用微流控技术对工业真菌进行高通量筛选的方法，例如陈宇锟等人利用液滴微流控设备对地衣芽孢杆菌进行高通量筛选，获得高产α-淀粉酶的突变菌株；例如白立宽等人将单个链霉菌包埋在液滴中培养，进一步与生物传感器结合，获得了高产红霉素的目标菌株。

微流控筛选的常见步骤包括：菌液培养、液滴生成、液滴培养以及液滴分选；将菌株培养液水相作为内相，皮升大小的单分散油包水液滴在连续氟化油相中快速生成，在内外相溶液体系中引入表面活性剂使液滴之间保持稳定，减少融合，这些液滴能够以每秒数千次的频率在微流控装置中产出，达到百千万量级。单个突变体菌株被封装在液滴中，每个液滴相当于一个微型反应器，实现单一细胞独立分析，无交叉污染，同时，在微流控装置内，液滴允许多种形式的操作，包括分裂、融合、捕获、注入试剂和分选等，由特定的微通道设计来完成。随后，经过一段时间的液滴内培养，菌体分泌胞内或胞外产物，选用合适的产物检测信号（如荧光、吸光度、拉曼光谱等）以适配高通量分选。液滴分选可以被动地根据物理属性（如尺寸）驱动，也可以通过按需激活实现主动分类，比如对液滴施加介电泳力的电场等等。然而，现有的液滴通常由简单的微生物培养液构成，存在许多缺点，例如，保水性能差，孵育时间长之后液滴会挥发收缩影响菌株的生长；藤仓赤霉菌是一种丝状真菌，在培养过程中会产生大量菌丝，后期菌丝极易戳破液滴，从而造成渗漏，出现交叉污染；常规使用的聚合物芯片无法作为液滴长期培养的介质，必须将液滴转移到其他玻璃容器中，而在转移过程中，液滴容易受到扰动发生破裂甚至二次乳化，这对后续的准确筛选造成了极大的影响。因此，在将液滴分选应用于筛选藤仓赤霉菌时，亟需建立一种能够增强液滴形貌和尺寸稳定性的液滴分选方式。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的保水性能差、不能满足藤仓赤霉菌长期培养、转移时液滴易破破裂的问题，提供一种高通量筛选微生物菌株的方法，该方法能够保持微生物的生长形状，增强液滴形貌，有效避免微球破裂，便于对微球进行准确筛选获得所需的微生物菌株。

为了实现上述目的，本发明提供一种高通量筛选微生物菌株的方法，包括以下步骤：

（1）建立微生物突变体库，构建微流控芯片；

（2）利用微流控芯片对所述微生物突变体库中的菌株进行包埋形成液滴，其中，所述液滴的外相为含有表面活性剂的氟化油、内相为所述微生物突变体库菌株的培养液与水凝胶的混合物，所述内相的相变温度为所述微生物的生长温度；

（3）将所述液滴进行液滴培养后固化形成微球，对所述微球进行微流控分选。

优选地，步骤（1）中所述建立微生物突变体库采用紫外辐照、等离子体诱变和化学诱变中的至少一种。