[发明专利]一种mRNA的加帽方法

说明书

本发明公开了一种mRNA加帽的方法。所述方法包括：将mRNA连接在固定相后进行加帽反应，得到加帽的mRNA。本发明创造性地建立了一种基于固定化mRNA的加帽反应‑分离耦合策略，提供一种高效，简便，低成本的加帽方法，加帽操作既可以间歇操作，也可以在柱子上连续操作，为mRNA新型生产工艺的开发及应用提供了研究基础。

技术领域

本发明属于核酸技术领域，涉及一种mRNA的加帽方法。

背景技术

天然mRNA具有单链结构，由5’端甲基鸟苷酸帽(5’-cap)、3’端多聚腺苷酸尾(3’-polyA)以及中间的蛋白翻译区和非翻译区组成。其中，5’-cap可以消除mRNA序列中的游离磷酸基团，防止核糖核酸酶和核酸外切酶对mRNA的消化，从而显著提高mRNA的稳定性，同时，5’-cap能够促进核糖体识别mRNA，并通过与真核翻译起始因子4E(eIF4E)结合来提高翻译效率。根据5’-cap中甲基化的程度，mRNA中存在三种类型的帽，即cap-0(m⁷GpppN)、cap-1(m⁷GpppNm)和cap-2(m⁷GpppNmNm)。免疫细胞中的模式识别受体(PRRs)可以识别未加帽的mRNA或具有cap-0帽的mRNA并抑制其翻译。然而，具有cap-1和cap-2帽结构的mRNA在被识别后仍然被翻译。当前治疗用的mRNA均由体外转录获得，即在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板转录生成mRNA。为了提高转录后mRNA的结构稳定性和翻译效率，需进一步对其进行加帽。

目前mRNA的加帽方法包括酶法加帽、共转录法加帽、化学法加帽。其中最常用的是酶法加帽，即首先通过具有三种酶活性的牛痘病毒加帽酶产生cap-0帽，其具体的反应机制为：mRNA在RNA三磷酸酶的作用下脱去一个5’端的磷酸基团，之后鸟苷转移酶将三磷酸鸟苷(GTP)分子中的单磷酸鸟苷(GMP)结构添加至脱去一个磷酸基团的mRNA上，最后通过鸟苷甲基转移酶的催化在鸟嘌呤结构的N7端添加一个甲基，从而生成具有cap-0帽结构的mRNA。此外，在2-O’甲基转移酶的作用下，具有cap-0帽结构的mRNA能够在2-O’端添加一个甲基生成具有cap-1帽结构的mRNA。但酶法加帽法反应组分较多，需要经过“吸附-洗脱-加帽-再吸附-再洗脱”的五步操作才能够获得纯化的加帽mRNA，分离步骤多，成本高，mRNA产量低，损失大，易降解。

WO2016193226A1公开了一种利用固定化加帽酶对RNA加帽的方法，所述方法中，牛痘病毒加帽酶和2’-O-甲基转移酶的固定相均为环氧甲基丙烯酸磁珠，该固定相经过环氧基活化后能够与酶分子的半胱氨酸形成巯基，从而进行两种加帽酶的固定，其固定条件为：100mM磷酸钾、500mM氯化钠、1mM乙二胺四乙酸(pH7.5)，在20℃固定60min后，其上清液中的蛋白酶浓度经测定基本为0，说明该方法固定化加帽酶的效率较高。经过高效液相色谱柱进行分析，加帽酶在通过该方法固定化后具有较高的活性和稳定性。但该方法仍需要先利用介质把mRNA吸附-洗脱进行分离，然后与固定化的加帽酶结合进行加帽反应，后续仍需要把mRNA从除加帽酶之外的其他组分中分离出来，存在造成mRNA损失等问题。

CN112626177A公开了一种快速定量检测RNA加帽效率的方法，所述方法步骤包括S1.体外转录合成未加帽的RNA并除去模板DNA；S2.对RNA进行加帽处理；S3.对经S1、S2步骤得到的RNA进行单磷酸化处理：先利用碱性磷酸酶去磷酸化，RNA纯化后再利用多聚核苷酸激酶在RNA的5’端加上单磷酸；S4.用单磷酸酶除去进行单磷酸化处理后的RNA，并设置不用单磷酸酶处理的对照组；S5.跑胶检测，定量测定用单磷酸酶处理的RNA的条带亮度(记为n)以及对照组的RNA的条带亮度(记为N)，计算RNA的加帽效率为：(n/N)×100％。该方法可快速定量地检测出RNA的加帽效率，操作简单快速，结果有效准确，对样品需求量少，对RNA类型、长度等无特殊要求，适用范围广。但此方法存在加帽前后分离步骤多，纯化容易造成mRNA的质量损失，工艺时间长，并容易导致mRNA的降解等问题。