[发明专利]一种mRNA的加帽方法在审
| 申请号： | 202211659059.2 | 申请日： | 2022-12-22 |
| 公开（公告）号： | CN115948382A | 公开（公告）日： | 2023-04-11 |
| 发明（设计）人： | 张松平;苏志国;车诗怡;李正军;林旋;冯雪 | 申请（专利权）人： | 中国科学院过程工程研究所 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12P19/34 |
| 代理公司： | 北京品源专利代理有限公司 11332 | 代理人： | 陈小龙 |
| 地址： | 100190 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 mrna 方法 | ||
1.一种mRNA加帽的方法，其特征在于，所述方法包括：将mRNA连接在固定相后进行加帽反应，得到加帽的mRNA。
2.根据权利要求1所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述mRNA由体外转录获得；
优选地，所述体外转录的反应体系包括RNA聚合酶和DNA模板；
优选地，所述RNA聚合酶包括T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶或T3RNA聚合酶中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述DNA模板为具有编码蛋白质功能的DNA序列，包括线性化质粒、PCR产物、合成的DNA片段中任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述mRNA通过非共价作用与固定相连接；
优选地，所述非共价作用包括疏水作用、静电作用、亲和作用中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述固定相包括表面修饰有能和mRNA结合的配基的固体材料；
优选地，所述能和mRNA结合的配基包括疏水配基、阳离子配基、亲和配基中任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述加帽反应包括将mRNA与mRNA加帽酶接触，在mRNA的5’端添加帽子结构。
5.根据权利要求4所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述mRNA加帽酶包括mRNA加帽酶1和mRNA加帽酶2；
优选地，所述mRNA加帽酶1包括由D1和D12两个亚基组成的异质二聚体，更优选来源于牛痘病毒的加帽酶；
优选地，所述mRNA加帽酶2包括2-O’甲基转移酶。
6.根据权利要求1-5任一项所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述加帽的mRNA的5’端帽子结构包括cap-0(m7GpppN)、cap-1(m7GpppNm)或cap-2(m7GpppNmNm)中任意一种。
7.根据权利要求1-6任一项所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述的mRNA加帽的方法包括以下步骤：
(1)将mRNA连接到固定相上；
(2)对连接在固定相上的mRNA进行加帽反应；
(3)洗去未反应的组分；
(4)将加帽后的mRNA从固定相上解离。
8.根据权利要求7所述的mRNA加帽的方法，其特征在于，所述mRNA连接到固定相上的方法包括：将mRNA与结合缓冲液混合，加热后至于冰浴上冷却，后将mRNA加入预先用结合缓冲液平衡后的固定相中，进行结合；
优选地，所述结合缓冲液包括Tris-盐酸、氯化钠、乙二胺四乙酸、硫酸铵中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述Tris-盐酸的浓度为0-50mM；
优选地，所述氯化钠的浓度为0-1M；
优选地，所述乙二胺四乙酸的浓度为0-1mM；
优选地，所述硫酸铵的浓度为0-1M；
优选地，所述加热的温度为35-65℃；
优选地，所述加热的时间为5-10min；
优选地，所述mRNA与固定相的结合比为0.2-8μg/μL，更优选为1-4μg/μL；
优选地，所述结合温度为25-65℃；
优选地，所述结合的时间为5-120min。
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