[发明专利]基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法在审
| 申请号： | 202211644474.0 | 申请日： | 2021-04-09 |
| 公开（公告）号： | CN116411113A | 公开（公告）日： | 2023-07-11 |
| 发明（设计）人： | 赵辉;杨小亮;段志强;李峰;郭安平 | 申请（专利权）人： | 中国热带农业科学院三亚研究院;山东舜丰生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京汇智英财专利代理有限公司 11301 | 代理人： | 张伟 |
| 地址： | 572000 海南省三亚市*** | 国省代码： | 海南;46 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 crispr cas 基因 编辑 技术 转基因 成分 检测 方法 | ||
1.基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1：通过CTAB法提取植物DNA；
步骤S2：制备DNA的RPA等温扩增引物；
步骤S3：构建反应体系如下：以体积份数计，每份反应体系各包括如下体积份的各成分：2份10xNE缓冲液2.1、1份1uM引导及折叠序列、1份1uMLba Cas12a、1份RNA酶抑制剂、1份转基因植物DNA提取物的RPA等温扩增产物、1份反应标记物及13份水；
步骤S4：通过包括但不限于酶标仪、定量PCR仪或试纸条显色技术进行植物转基因成分的检测；该方法用于检测植物转基因成分HPT基因，引物如下：
引导及折叠序列如下：其中，加粗的为引导序列；
引导及折叠序列经过硫代修饰,硫代修饰情况如下：
2.如权利要求1所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：
步骤S21：以体积份数计，分别将如下体积份的各成分混合：2.2-2.5份第一引物、2.2-2.5份第二引物、29-20份Primer Free Rehydrationbuffer、2份步骤S1提取的DNA、11-12份水；
步骤S22：将步骤S21中各成分混匀，瞬时离心；
步骤S23：将所获取的混合液加入到TwistAmp Basic reaction，混匀；
步骤S24：加入2.5份体积份的280mM MgOAc，混匀
步骤S25：38-40摄氏度下反应20分钟；
步骤S26：-20摄氏度下保存备用。
3.如权利要求1所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，其特征在于：
酶标仪检测的反应标记物选自S2或S4，标记方法：两端分别带有FAM和BHQ1基团的含TAT碱基序列单链DNA分子，S2为5`6-FAM-TTAT-3`BHQ1，S4为5`6-FAM-TAT-3`BHQ1；
试纸条检测的反应标记物选自S3，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TAT-Biotin-3`；
定量PCR仪检测的反应标记物选自S5，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TTATT-3`BHQ1。
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