[发明专利]一种与鹅精子活力相关的miRNA及其应用

权利要求书

1.一种与鹅精子活力相关的miRNA，其特征在于，所述miRNA的靶基因是NKAIN3。

2.根据权利要求1所述的与鹅精子活力相关的miRNA，其特征在于，所述miRNA为gga-miR-140-3p，其核苷酸序列为CCACAGGGUAGAACCACGGAC。

3.权利要求1或2所述的miRNA作为分子标记在鹅精子活力评估中的应用。

4.一种评估鹅精子活力高低的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)精液样品的采集与储存；

(2)RNA提取、文库构建和转录组测序；

(3)miRNA及mRNA差异表达分析；

(4)miRNA和mRNA联合分析筛选关键miRNA；

(5)荧光定量PCR验证。

5.根据权利要求4所述的评估鹅精子活力高低的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，综合精子活力及种蛋受精率数据，经统计学检验，筛选出高精子活力公鹅组和低精子活力公鹅组，屠宰取公鹅同侧睾丸组织置于液氮保存，随后转入-80℃超低温冰箱保存。

6.根据权利要求5所述的评估鹅精子活力高低的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，利用RNA提取试剂盒提取睾丸组织总RNA，构建用于转录组测序的文库，之后进行转录组的测序。

7.根据权利要求6所述的评估鹅精子活力高低的检测方法，其特征在于，采用Trizol法分别提取高精子活力公鹅组和低精子活力公鹅组样品的RNA，并分别用琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop、Agilent 2100三种方法进行质量检测；RNA完整性数值≥8.5的样品被用于进一步分析；

样品通过质量控制后，根据Illumina试剂盒的说明构建高精子活力公鹅组和低精子活力公鹅组样品的cDNA文库；

使用Illumina HiSeq2500高通量测序平台测序，测序读长为双末端测序150bp；

根据Small RNA Sample Pre Kit构建高精子活力公鹅组和低精子活力公鹅组样品的miRNA文库；进行Illumina SE50测序。

8.根据权利要求7所述的评估鹅精子活力高低的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，对各样本中已知和新miRNA进行表达量的统计，并用TPM进行表达量归一化处理；采用基于负二项分布的DESeq2进行差异表达分析，按照P0.05筛选出差异表达miRNA；

采用HTSeq软件对各样品进行基因表达水平分析，采用edgeR软件进行表达差异显著性分析，将P＜0.05，|log₂Foldchange|2的基因作为差异表达基因。

9.根据权利要求8所述的评估鹅精子活力高低的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，应用miRanda和RNAhybrid软件对差异表达miRNA进行靶基因和靶位点预测；结果表明，所述miRNA为gga-miR-140-3p，所述gga-miR-140-3p能够靶向结合NKAIN3基因；

利用Cytoscape软件构建并可视化差异表达的miRNA和预测的目标mRNA之间的相互作用网络；

采用GOseq软件对差异表达miRNA的靶基因进行GO富集分析，使用KOBAS对差异表达miRNA的靶基因进行KEGG通路富集分析。

10.根据权利要求9所述的评估鹅精子活力高低的检测方法，其特征在于，步骤(5)中，对gga-miR-140-3p进行荧光定量验证，具体为：

使用Oligo 7.0软件进行引物设计，使用SYBR GEEN试剂在ROCHE 480定量PCR仪中完成目标基因和内参基因相对表达量检测；

PCR反应体系为：AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL，10μmol/L上游引物0.4μL，10μmol/L下游引物0.4μL，ddH₂O 6.7μL，cDNA 2.5μL；PCR反应条件为：95℃5min，95℃10s，60℃30s，40个循环；溶解曲线:60℃→95℃，每15s升温0.3℃；定量表达结果依据CP数值，根据2'^-ΔΔCt法，计算其相对表达量；

所述gga-miR-140-3p的引物对序列为：F：CGCGCCACAGGGTAGAAC，R：CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT；

内参基因U6的引物对序列为：F：GGAACGATACAGAGAAGATTAGC，R：CGGAACGCTTCACGAATTTG；

所述靶基因NKAIN3的引物对序列为：F：GCTGCATACGAAGGGTGGT，R：CAGCCTGTCACAGAGACGTAG；

内参基因GAPDH的引物对序列为：F：TGATGCTCCCATGTTCGTGATG，R：GTGATGGCATGGACAGTGGT。