[发明专利]一种用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物及其制备方法与应用。该基因纳米药物通过超声双乳化等方法将可以增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因激活工具CRISPRa表达质粒或基因过表达质粒包载到阳离子脂质辅助的聚合物纳米颗粒当中。此基因纳米药物不仅可以通过调节纳米颗粒的阳离子脂质种类、电势以及PEG密度等特性提升其在肿瘤中的富集与内化；并且通过向质粒中引入肿瘤特异性启动子，可实现肿瘤部位趋化因子以及免疫检查点阻断剂等免疫效应分子的特异性表达。因而此基因纳米药物可以高效、特异且安全地增强肿瘤部位T细胞的浸润与活化等抗肿瘤免疫效应，在多种实体瘤的治疗中有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物及其制备方法与应用。

背景技术

癌症是全球性的公共健康问题，已成为我国第一大死因，严重威胁着我国居民的健康。近年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，其中T细胞扮演着关键角色。T细胞主要通过识别抗原提呈细胞提呈的肿瘤抗原、动员后向肿瘤部位迁移浸润、识别肿瘤细胞后活化并发挥细胞毒性作用进行肿瘤杀伤。研究人员已开发出多种策略增强T细胞抗肿瘤作用，例如免疫检查点抗体阻断、CAR-T细胞疗法等，但这些免疫疗法的临床效果并不乐观。这是因为多数实体瘤属于T细胞难以浸润的“冷”肿瘤、抗体药物难以高效进入肿瘤组织，并且药物非特异作用会引发免疫相关不良反应等，极大地限制了T细胞抗肿瘤免疫功能的效果。因此，亟需发展增强T细胞抗肿瘤免疫作用的新策略。

在肿瘤杀伤过程中，T细胞(效应T细胞为主)的浸润主要依靠细胞表面的趋化因子受体CXCR3，接收肿瘤组织表达的趋化因子的信号，包括趋化因子配体9(CXCL9)、趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子配体11(CXCL11)等，向实体瘤内浸润。然而，多种实体瘤都会下调这些趋化因子的表达，抑制T细胞向实体瘤浸润。已有研究人员通过瘤内注射趋化因子重组蛋白或系统注射趋化因子病毒表达载体提升T细胞向肿瘤浸润。免疫检查点抗体药物可以高效解除免疫检查点信号通路对T细胞杀伤功能的抑制，但传统抗体药物给药方式为全身给药，会导致其在肿瘤组织中的利用率较低，且在非肿瘤部位会引起不良反应。已有研究人员利用局部给药或靶向给药系统提升抗体药物的肿瘤富集。如何增加T细胞的趋化与活化提升T细胞抗肿瘤效应，为肿瘤免疫治疗的关键点。

CRISPR介导的基因激活工具CRISPRa表达质粒通过表达失活核酸内切酶dCas9结合不同引导RNA(gRNA)将转录激活因子招募至转录起始位点，可以成千上万倍地激活多种内源基因的表达。目前已有多种研究通过CRISPRa上调特定基因表达进行不同疾病的治疗。基因过表达质粒可以通过过表达一种或多种特定基因从而同时增加一种或多种功能蛋白的水平。它是一种有力的基因治疗工具，已在恶性肿瘤、遗传病、感染性疾病、心血管疾病以及自身免疫疾病等中取得了一定的效果。利用CRISPRa上调肿瘤细胞趋化因子的表达或利用基因过表达质粒驱使肿瘤细胞高效表达趋化因子与免疫检查点阻断剂有望增强T细胞向实体瘤的定向浸润与活化，提升抗肿瘤疗效，但CRISPRa质粒以及基因过表达质粒在实际应用中还存在许多限制因素。

首先，常用的CRISPRa系统有多种，以激活效果最强的dCas9-SAM系统为例，整个系统包括165kDa的dCas9转录激活域融合蛋白dCas9-VP64、161bp的内源基因特异性MS2gRNA、46kDa的转录激活辅助蛋白MS2-p65-HSF1。整个系统的核苷酸数量超过5.8kb，而常用的病毒载体的包装容量有限，大多不超过4.7kb。病毒载体递送时需要将此系统进行拆分，以三质粒的形式进行包装，大大地降低了基因表达效率。另外，病毒元件具有免疫原性，会引起免疫相关反应；病毒存在随机整合到基因组的致癌风险；病毒设计复杂且难以规模化生产。基因过表达质粒在进行多基因表达时也会面临以上问题。其次，常用的质粒表达骨架均使用强启动子如CMV、CBh或EF1α启动子驱动目的基因表达，这种方式不具有细胞或组织特异性，进入体内也会对除肿瘤组织外的正常组织进行非特异地基因操纵，从而引发不良反应。