[发明专利]用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针及应用、试剂盒和烟草靶斑病菌快速检测方法

说明书

本申请提供用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针及应用、试剂盒和烟草靶斑病菌快速检测方法，涉及烟草防治技术领域。该用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针通过试验优化筛选出，对烟草靶斑病菌具有较高的特异性，其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。通过该用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针进行RPA扩增烟草靶斑病菌目的基因，并使用侧流层析试纸条进行可视化检测目的基因，具有灵敏度高、特异性好，且操作时间短的优点。

技术领域

本申请涉及烟草防治技术领域，尤其涉及用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针及应用、试剂盒和烟草靶斑病菌快速检测方法。

背景技术

烟草靶斑病是由立枯丝核引起的一种真菌性病害，瓜亡革菌的无性态为立枯丝核菌。烟草靶斑病从苗期至烟叶成熟时均可发生，既侵染叶片，也危害茎部。侵染叶片初为圆形水渍状斑点，如温度较高、湿度大、叶片湿润时间较长，则病斑迅速扩展，形成直径2-20厘米的不规则斑，有同心轮纹，形成褪绿晕圈枯斑，病斑坏死部分易碎形成穿孔，形似枪弹射击后留下在靶子上的空洞，故称靶斑病。

烟草靶斑病不易被发现，一旦流行便发展迅速，防治困难，给农户们造成了极大的损失，阻碍了烟草种植产业的发展。目前对该病害的检测方法主要包括，病原菌分离和鉴定，以及普通的PCR和荧光定量PCR鉴定。这些方法对专业要求比较高，且过程繁琐，耗时长，不能达到高效经济地检测要求。

发明内容

本申请的目的在于提供用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针及应用、试剂盒和烟草靶斑病菌快速检测方法，旨在解决现有的烟草靶斑病菌使用普通PCR进行检测，过程繁琐、耗时长的问题。

为实现以上目的，本申请提供用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针，所述引物包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；

所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；

所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；

所述下游引物的5’端和所述探针的5’端分别具有抗原标记。

优选地，所述下游引物的5’端具有生物素标记，所述探针的5’端具有荧光标记；

所述荧光标记包括AMC、FAM、FITC中的任一种。

优选地，所述探针包括如下特征中的至少一个：

a.所述探针的中间序列含有核苷酸类似物；

b.所述核苷酸类似物包括四氢呋喃残基；

c.所述探针的3’端具有聚合酶延伸阻断基团；

d.所述聚合酶延伸阻断基团包括C3-间隔基、磷酸基、双脱氧核苷酸中的任一种。

本申请还提供上述的用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针在烟草靶斑病菌检测中的应用。

本申请还提供用于快速检测烟草靶斑病菌的试剂盒，包括上述的用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针。

优选地，所述试剂盒还包括重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。

优选地，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条，所述侧流层析试纸条包括检测带和质控带，所述检测带固定有生物素抗体，所述质控带固定有荧光标记抗体。

本申请还提供一种烟草靶斑病菌的快速检测方法，包括：

使用上述的用于快速检测烟草靶斑病菌的引物和探针对所述烟草靶斑病菌的DNA进行RPA扩增得到扩增产物；

将所述扩增产物使用侧流层析试纸条进行可视化检测。