[发明专利]一种融合基因、表达载体及抗糖尿病药物筛选方法

说明书

本发明公开了一种融合基因、表达载体及抗糖尿病药物筛选方法，该方法以真核表达载体pCDNA3.1为基础，插入人工合成的EBFP2‑T2A‑SGLT2融合基因而获得新的表达载体pBTS，转染HEK293细胞而获得同时表达蓝色荧光蛋白（EBFP2）和人源钠‑葡萄糖协同转运蛋白（SGLT2）的基因工程细胞，该基因工程细胞所表达蓝色荧光蛋白EBFP2用于评价转染效率，也可以作为计算SGLT2转运荧光葡萄糖的内参，自裂肽T2A用于连接EBFP2和SGLT2，在细胞内表达的同时能够胞内蛋白酶裂解而获得独立的SGLT2蛋白，能够更好的保持SGLT2在细胞内的真实构象，从源头上解决融合蛋白可能对SGLT2活性及其对荧光葡萄糖转运能力的影响，在活性检测过程中体现真实SGLT2的生物学活性，保证了药物检测结果的准确性、可重复性。

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，特别是一种融合基因、表达体系及其在以SGLT2蛋白为靶点的抗糖尿病药物筛选方法的建立及应用。

背景技术

根据国际糖尿病联合会（International Diabetes Federation，IDF）第10版《全球糖尿病地图》数据显示，截止2021年12月全球20-79岁成年人糖尿病患者达5.37亿（10.5%），糖尿病总人数预计到2030年将增至6.43亿（11.3%），到2045年将增至7.83亿（12.2%）。中国成年人糖尿患者达1.409亿，总人数居于全球首位，预计至2045年将达到1.744亿。糖尿病已经成为一种全球性的多发性疾病，严重威胁人类的生命健康。

血糖平衡对人体的新陈代谢至关重要，而维持循环系统血糖平衡需要多个器官的协调作用，例如消化道对碳水化合物的吸收转化、组织器官对葡萄糖的摄取和利用，肝脏中汤圆的合成与分解、胰腺对血糖稳态的调节等，还包括肾脏在血糖平衡调节中也发挥重要作用。肾脏主要通过三方面对血糖水平进行调节：（1）肾脏葡萄糖通过糖异生进入血液循环；（2）肾脏活动对葡萄糖的消耗利用；（3）肾脏对葡萄糖的重吸收。研究发现，健康成年人肾脏中的肾小球每天约过滤180g的葡萄糖，而其中约99%被肾近端小管重吸收进入血液循环，剩余1%则以尿液形式排出体外。肾脏中对葡萄糖重吸收起重要作用的跨膜转运蛋白主要有钠-葡萄糖1型转运体和钠-葡萄糖2型转运体（SGLT1和SGLT2），其中SGLT1是一种低容量、高亲和力的转运体，以钠-葡萄糖2:1的比率转运葡萄糖和半乳糖，负责转运肾脏内约10%的葡萄糖重吸收，但因为SGLT1在小肠和其他组织中也有广泛表达，SGLT1的抑制有可能导致葡萄糖-半乳糖吸收不良综合征以及胃肠道相关的副作用。SGLT2是一种高容量、低亲和力的转运体，以钠-葡萄糖1:1的比率转运葡萄糖，负责肾脏90%葡萄糖的重吸收。另外，因SGLT2主要分布于肾脏，葡萄糖重吸收率高，选择性阻断SGLT2能特异性地抑制肾脏葡萄糖的重吸收，促使葡萄糖从尿液排出体外，从而达到降低血糖浓度的作用。综上所述，SGLT2是目前比较理想的抗糖尿病药物作用靶点，而且SGLT2抑制剂不依赖于胰岛素作用，可用于糖尿病发展的任何阶段。一系列临床数据显示SGLT2抑制剂的服用在有效控制血糖的同时，还能够改善β细胞功能、提高胰岛素敏感性、降低患者体重、减轻心血管并发症几率。

以SGLT2为靶点的抗糖尿病药物筛选方法已有报道，该系统以增强型绿色荧光蛋白（eGFP）作为报告基因，通过转染panc-1胰腺细胞作为细胞模型，以绿色荧光葡萄糖分子（2-BNDG）作为底物，通过流式检测2-BNDG信号来评价药物对SGLT2抑制活性，所存在的问题：

该筛选系统所采用报告基因eGFP和底物分子2-BNDG的激发波长均为488 nm，仅发射波长分别为507 nm和542 nm，采用流式细胞仪难以准确排除eGFP的干扰而获得准确的2-BNDG的荧光值，导致背景高、灵敏度低；

该筛选系统所采用的细胞为panc-1胰腺细胞，而不是SGLT2表达及发挥转运葡萄糖分子功能的人肾脏来源的细胞，所体现的葡萄糖转运效率及作用可能与体内实际情况存在差异；

该筛选平台的建立需构建过表达稳转细胞系，方法单一，步骤繁琐；

该筛选系统中细胞荧光信号需要昂贵的流式细胞仪检测，检测方法复杂，不适合药物的高通量筛选。