[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，其特征在于：所述疫苗通过将猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的N蛋白基因替换为Betaarterivirus属病毒的N蛋白基因得到。

2.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，其特征在于：所述的Betaarterivirus属病毒为Betaarterivirus chinrav 1，Betaarterivirus ninra，Betaarterivirus sheoin，Betaarterivirus suid 1，Betaarterivirus timiclar中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，其特征在于：所述猪繁殖与呼吸综合征病毒株2型毒株为SC2012株。

4.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，其特征在于：所述疫苗的基因组序列包括如序列2所示的核苷酸序列。

5.一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗制备方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：

1)选取毒株PRRSV SC2012株F5代及F80代，F80代为连续传代后制备而成的弱毒株，感染仔猪后无体温反应，感染动物不发病；

2)PRRSV全基因组序列的扩增与感染性克隆的构建，具体工艺步骤如下：

按照常规方法提取PRRSV SC2012株F80代病毒RNA并进行反转录，使用引物进行序列扩增，按照常规方法回收扩增片段，然后将回收片段与经NheⅠ和NotⅠ酶切的pVAX1载体按照克隆试剂盒操作说明书进行载体组装，然后转化TOP感受态细胞，挑选菌落提取质粒进行测序验证，将测序正确的载体命名为pVAX-PRRSV SC2012；

3)合成Betaarterivirus属毒株N蛋白基因序列,替换载体pVAX-PRRSV SC2012中的部分序列，构建获得的载体命名为pVAX-PRRSV-DIVA；

4)传代Marc145细胞和BHK21细胞，将比例为1:1的Marc145和BHK21细胞汇合度达到70％或以上时分别转染pVAX-PRRSV-DIVA和pVAX-PRRSV SC2012质粒，37℃5％CO₂培养箱中培养，转染后72小时收获上清，接种新传代的Marc145细胞，37℃5％CO₂培养箱中培养，连续传代至F5代，分别将其标注为rPRRSV-DIVA和rPRRSV SC2012。

6.根据权利要求4所述的一种猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗制备方法，其特征在于：1)中，使用引物进行序列扩增时，引物为：PRRSV-1F、PRRSV-1R、PRRSV-2F、PRRSV-2R、PRRSV-3F、PRRSV-3R、PRRSV-4F、PRRSV-4R、PRRSV-5F、PRRSV-5R、PRRSV-6F、PRRSV-6R。

7.根据权利要求5所述的一种猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗制备方法，其特征在于，各引物对应的引物序列具体为：

8.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗制备方法，其特征在于：

3)中，合成序列1所示；

3)中，替换的部分序列如序列3所示。