[发明专利]NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变转基因小鼠及其构建方法和应用

说明书

本申请公开了NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变转基因小鼠的构建方法，包括以下步骤：构建带有LoxP序列并定点敲入NOTCH2NLC基因的F0代阳性小鼠；将F0代阳性小鼠与野生型小鼠交配并繁殖，鉴定出阳性F1代杂合子条件性转基因小鼠；将阳性F1代杂合子条件性转基因小鼠与野生型小鼠回交m代，得到Fsubgt;(1+m)/subgt;代杂合子条件性转基因小鼠；将Fsubgt;(1+m)/subgt;代杂合子条件性转基因小鼠之间交配并繁殖，得到纯合子条件性转基因小鼠；将Fsubgt;(1+m)/subgt;代杂合子条件性转基因小鼠或纯合子条件性转基因小鼠与cre工具小鼠杂交，获得转基因小鼠。本申请解决了相关技术中的如何构建稳定的神经元核内包涵体病动物模型的技术问题。

技术领域

本发明属于动物模型构建的生物医学技术领域，具体而言，涉及NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变转基因小鼠及其构建方法和应用。

背景技术

神经元核内包涵体病(Neuronal Intranuclear Inclusion Disease，NIID)是一种以广泛存在的神经元核内包涵体为特征的致死性神经退行性疾病。NIID的临床表现复杂多样，主要表现为肌无力和痴呆，此外还可见帕金森样症状、小脑共济失调、震颤、发作性的意识障碍、感觉障碍和运动障碍等症状。2019年NOTCH2NLC基因GGC重复扩增被报道为NIID致病基因突变后，越来越多的NIID病例得到确诊。随后，各国科学家陆续在亚洲人群原发性震颤、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、脑白质病变和多系统萎缩等疾病部分患者中也检测到相同基因突变，而在欧洲人群相应疾病中没有或很少检测到该突变，这表明该基因突变可能在亚洲人群神经退行性疾病的发生中发挥重要作用。然而，NIID发病的具体分子机制尚无任何报道，亟待开展相关研究。

人类疾病的动物模型，是生物医学科学研究中所建立的具有人类疾病模似性表现的动物实验对象和材料，是现代生物医学研究中的一个极为重要的实验对象和工具，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施。实验小鼠由于容易饲养、繁殖率高、遗传上有较高的纯和度、世代周期短、个体间差异小、代谢类型、生理病理与人类接近、有高级神经活动等特点，成为现代生物医学研究领域中应用最广泛的模式动物。

2021年，法国科学家通过注射腺相关病毒过表达NOTCH2NLC基因GGC重复扩增，证明该模型能够部分模拟患者行为及病理表型；然而，通过注射腺相关病毒过表达方法建立的小鼠模型不能够稳定的向下一代传递该突变，从而导致该小鼠模型在探索疾病发病机制、开发治疗药物等方面的应用受到诸多限制。

针对相关技术中的如何构建稳定的神经元核内包涵体病动物模型的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

发明内容

本申请的主要目的在于提供NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变转基因小鼠及其构建方法和应用，以解决构建稳定的神经元核内包涵体病动物模型的问题。本申请通过CRISPR/Cas9、胚胎干细胞打靶、显微注射等技术建立了世界上首个携带NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变的转基因小鼠，该转基因小鼠模型能够稳定的将NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变进行代际传递，能够模拟患者的各种病理特征及临床表型。该小鼠模型将为NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变相关疾病的发生发展机制、药物筛选及疗效评价提供重要的动物模型。

为了实现上述目的，第一方面，本申请提供NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变转基因小鼠的构建方法，包括以下步骤：

S1，构建带有LoxP序列并定点敲入NOTCH2NLC基因的小鼠：在小鼠体内的Rosa26基因位点，定点插入CAG-Loxp-Stop-Loxp-NOTCH2NLC-(GGC)n-3tag-WPRE-polyA表达框，繁育并鉴定出F0代阳性小鼠；所述n为自然数，且n≥60；

S2，将F0代阳性小鼠与野生型小鼠交配并繁殖，获得F1代小鼠，鉴定出阳性F1代杂合子条件性转基因小鼠；