[发明专利]高纯度效应免疫细胞群及其培养方法、试剂组合物和应用

说明书

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种高纯度效应免疫细胞群及其培养方法、试剂组合物和应用。该试剂组合物包括包被液、活化培养基和扩增培养基。包被液为RetroNectin；活化培养基由无血清培养基、CD3单抗、IL‑15、IL‑21和IL‑2组成；扩增培养基由无血清培养基和IL‑2组成。细胞培养方法为：先包被RetroNectin；再将细胞接种到包被RetroNectin的细胞培养瓶中，活化培养14天，在第一天、第四天及第六天分别添加10%、5%及2%血清替代物，此后无需添加，即可获得大量高纯度效应免疫细胞。该细胞对慢性髓性白血病细胞K562具有较高的杀伤能力，可用于治疗慢性髓细胞白血病。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种高纯度效应免疫细胞群及其培养方法、试剂组合物和应用。

背景技术

慢性髓细胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一种造血干细胞克隆增生性疾病，骨髓以髓系增生，外周血白细胞增多及脾脏肿大为主要特征。慢性髓细胞白血病在我国发病率较高，约占成年人白血病的15％~20％，现有治疗方法包括化学疗法、基因治疗、免疫治疗、骨髓移植、靶向药物治疗等，然而该类方法的治疗效果并不十分理想，大多存在着费用高、成功率低、副作用大等问题。

近年来，细胞治疗发展迅速。细胞作为一个独立的生命体，它具有很强的生命力、增殖分化能力和功能的可塑性能力。细胞疗法治疗疾病的机理主要分为两大类:一是细胞的直接作用，直接运用其特定的生物活性修复受损伤的组织和器官，或起到特异性/非特异性杀伤作用；二是细胞的间接作用，如分泌相关的因子或活性分子来调节患者自身细胞的增殖和功能活动。与传统恶性肿瘤治疗方法相比，细胞治疗具有疗效好、副作用小、更个体化、个性化等独特优势。已知的治疗性的细胞包括NK细胞、γδT细胞、CD3AK、CIK细胞等。CIK群体是由效应细胞CD3+CD56+细胞及CD3+CD8+细胞等组成的异质性细胞群。目前，CIK培养方法需要使用血清，并且存在增殖效率差、细胞纯度低、对肿瘤细胞的细胞毒性弱等问题，一定程度上阻碍了细胞免疫治疗的发展。

公开号为CN104357390A的发明专利公开了一种同时高效扩增CD3+CD56+CIK细胞和CD3-CD56+NK细胞的方法，具体为：用含自体血浆的无血清培养基调整分离的PBMC浓度，加入Anti-CD16抗体、IL-2、IL-15后转入T175培养瓶中培养，后再加入Anti-CD3抗体、Anti-CD137抗体，根据细胞的生长情况，每隔2天补充含自体血浆、IL-2和IL-15的无血清培养基，控制细胞浓度约1.5×10⁶/ml，培养14～21天即可。该专利未公开本发明的培养基，并且采用该细胞培养方法培养细胞，总细胞增殖倍数较低，不超过70倍。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于培养高纯度效应免疫细胞的试剂组合物，该试剂组合物通过使用游离状态的CD3单抗激活免疫细胞，获得特定比例的目的细胞。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于培养高纯度效应免疫细胞的试剂组合物，所述试剂组合物包括包被液、活化培养基和扩增培养基；所述包被液为终浓度为10-50ug/ml的RetroNectin；所述活化培养基由无血清培养基、终浓度为200-1000ng/ml的CD3单抗、终浓度为20-100ng/ml的IL-15、终浓度为20-100ng/ml的IL-21和终浓度为200-1000U/ml的IL-2组成；所述扩增培养基由无血清培养基和终浓度为200-1000U/ml的IL-2组成。

通常情况下，CD3单抗往往以包被的形式来激活免疫细胞，而本发明选择使用游离状态的CD3单抗激活免疫细胞，达到获得特定比例的目的细胞。

进一步，所述活化培养基由无血清培养基、终浓度为400-800ng/ml的CD3单抗、终浓度为30-90ng/ml的IL-15、终浓度为30-90ng/ml的IL-21和终浓度为500U/ml的IL-2组成。