[发明专利]梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mRNA疫苗的工艺方法

说明书

本发明梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mRNA疫苗的工艺方法，属于疫苗生产纯化技术领域，包括如下步骤：(1)质粒DNA纯化：取培养完成的菌液进行细胞裂解，裂解后采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到纯化质粒DNA；(2)mRNA纯化：纯化质粒DNA经体外转录、加帽加尾核苷酸修饰得到目标mRNA后，加入DNA酶，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到纯化mRNA；(3)mRNA包封或装载后纯化：纯化mRNA包封或装载后，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到mRNA疫苗。本发明方法可减少有机溶剂的使用，并且有利于实现mRNA疫苗的大规模连续化低成本纯化。

技术领域

本发明属于疫苗生产纯化技术领域，具体涉及梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mRNA疫苗的工艺方法。

背景技术

mRNA疫苗是将含有编码抗原蛋白的RNA导入人体，直接进行翻译，形成相应的抗原蛋白，从而诱导机体产生特异性免疫应答，达到预防免疫作用的一种疫苗，发展时间较短，2020年刚开始实现商业化产品上市。其只利用病毒的基因序列，不带有病毒成分，没有感染风险。人体以mRNA为模板翻译形成抗原蛋白，激发免疫反应，从而使人体获得免疫保护，体外转录的mRNA最终会被正常的细胞代谢过程自然降解。

mRNA疫苗生产工艺步骤为：构建含有抗原蛋白DNA的载体，转入菌株培养获得质粒DNA，质粒DNA体外转录、加帽加尾及核苷酸修饰后得到mRNA，mRNA利用聚合物或脂质纳米颗粒包封得到疫苗。在其生产过程中伴有蛋白质、内毒素、酶、游离核苷酸、核糖核苷三磷酸酯、DNA小片段等杂质，是限制mRNA疫苗纯度、造成临床使用后有较大副作用的关键因素。

目前主要采用以下方法进行mRNA生产过程中杂质的去除：如质粒DNA的纯化，可采用苯酚氯仿法进行抽提萃取，但过多有机溶剂的使用不利于疫苗整体质量的提高；亦可采用离心的方法分离质粒DNA，但离心方法无法连续大规模操作，无法实现mRNA疫苗的大规模纯化。

因此，减少使用有机溶剂，实现低成本连续化操作，对实现mRNA疫苗大规模纯化有非常重要的意义。

发明内容

本发明公开了梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mRNA疫苗的工艺方法，在减少有机试剂使用的同时有利于实现mRNA疫苗的连续化大规模稳定纯化。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mRNA疫苗的工艺方法，包括如下步骤：

(1)质粒DNA纯化：

取培养完成的菌液进行细胞裂解，裂解后采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到纯化质粒DNA；

(2)mRNA纯化：

纯化质粒DNA经体外转录、加帽加尾核苷酸修饰得到目标mRNA后，加入DNA酶，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到纯化mRNA；

(3)mRNA包封或装载后纯化：

纯化mRNA包封或装载后，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到mRNA疫苗。

本发明采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤的方法进行mRNA疫苗生产各阶段的纯化，沉淀和/或盐析处理试剂、参数以及梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤参数可根据各步骤需要除去的杂质进行调整，适应性强，且相对于传统的纯化方法可减少有机试剂的使用，最终获得的产品纯度高，适于连续化大规模生产。

进一步地，步骤(1)-(3)中，