[发明专利]梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mRNA疫苗的工艺方法

权利要求书

1.梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mRNA疫苗的工艺方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)质粒DNA纯化：

取培养完成的菌液进行细胞裂解，裂解后采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到纯化质粒DNA；

(2)mRNA纯化：

纯化质粒DNA经体外转录、加帽加尾核苷酸修饰得到目标mRNA后，加入DNA酶，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到纯化mRNA；

(3)mRNA包封或装载后纯化：

纯化mRNA包封或装载后，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，得到mRNA疫苗。

2.根据权利要求1所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mRNA疫苗的工艺方法，其特征在于，

步骤(1)-(3)中，

梯度孔结构中空纤维超滤膜材质分别为聚偏氟乙烯PVDF、聚醚砜PES、聚砜PSF、磺化聚醚砜SPES、磺化聚砜SPSF、改性聚醚砜mPES、改性聚砜mPSF、聚丙烯腈PAN中的至少一种，梯度孔结构中空纤维超滤膜切割分子量范围为50KDa-750KDa。

3.根据权利要求1所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mRNA疫苗的工艺方法，其特征在于，

步骤(1)-(3)中，

分别采用内压式中空纤维式膜组件进行过滤，组件中梯度孔结构中空纤维超滤膜直径为0.1-4mm，内外径之比为1.2-4；

过滤方法为切向流过滤或死端过滤；

死端过滤压力为0.05-0.3MPa，切向流过滤流速为15-150L/(h﹒m²)；

步骤(1)-(3)任一步骤过滤后均通过试剂I进行反冲洗；

反冲洗所用试剂I，包括盐酸缓冲液Tris-HCl、磷酸缓冲液Tris-H₃PO₄、乙二胺四乙酸缓冲液Tris-EDTA、乙酸缓冲液Tris-CH₃COOH中的至少一种，试剂I的浓度范围0.1mol/L～1mol/L，pH范围7-10。

4.根据权利要求1所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mRNA疫苗的工艺方法，其特征在于，

步骤(1)中，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤去除细胞碎片、蛋白质、宿主基因组DNA、RNA和内毒素；

步骤(2)中，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤去除酶、游离核苷酸、核糖核苷三磷酸酯、反应体系中的免疫原性杂质、外源RNA片段、dsRNA及DNA小片段；

步骤(3)中，采用沉淀和/或盐析处理配合梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤去除未包封或未装载的mRNA以及其他杂质。

5.根据权利要求4所述的梯度孔结构中空纤维超滤膜大规模纯化mRNA疫苗的工艺方法，其特征在于，

步骤(1)中，

细胞裂解后对蛋白质进行变性沉淀，抽取上清液采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤除去细胞碎片和内毒素，获得浓缩液I；

对浓缩液I中的宿主基因组DNA进行沉淀，抽取上清液采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，获得浓缩液II；

对浓缩液II中的RNA进行沉淀，抽取上清液采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，获得浓缩液III；

对浓缩液III中的质粒DNA进行沉淀，沉淀出的质粒DNA复溶过滤2-3次，采用梯度孔结构中空纤维超滤膜过滤，取最终浓缩液得到纯化质粒DNA。