[发明专利]一种快速构建禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法及其产品和应用

说明书

本发明公开了一种快速构建禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法，构建方法包括以YAC‑BAC穿梭质粒为骨架，采用TAR技术，运用酿酒酵母高效同源重组机制，快速完成包含禽传染性支气管炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建。本发明克服了冠状病毒IBV基因组较大难以操作；病毒基因组部分序列在细菌宿主中繁殖时的不稳定性；酶切位点不容易寻找，酶切连接效率低下等问题。同时构建以IBV病毒为载体嵌合外源报告基因的cDNA克隆，能够在以IBV为骨架的病毒载体中稳定表达外源基因，为以IBV病毒为载体嵌合外源基因的疫苗开发和表达外源报告基因的报告病毒的抗病毒药物筛选提供依据。

技术领域

本发明涉及冠状病毒反向遗传技术领域，具体涉及一种快速构建禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法及其产品和应用。

背景技术

传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)是困扰全球家禽业的主要禽类病毒病原体之一，是一种急性高度接触性呼吸道传染病，以喘息、鼻涕、咳嗽和气管罗音、也有报道称鸡蛋产量和质量大幅下降、肾脏病变及胃肠道病变为主要特征。自1931年首次分离以来，全世界已经发现了数量惊人的IBV变种。随着不同致病性和组织嗜性，不同血清型变种的不断出现，在不同血清型之间又缺乏有效的交叉保护，以及提供广泛保护的有效IBV疫苗的缺乏，给IBV的防控带来极大的困难，因此研究和理解这种经济上重要病原体的生物学特性至关重要。

禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)在系统分类上属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒亚科、γ冠状病毒属。在电子显微镜下，冠状病毒粒子大致呈球形，直径约为80-120nm。IBV基因组大小约为27.6kb，为不分节段的单股正链RNA。基因组的5'端三分之二包含两个开放阅读框(ORF)，它们共同构成复制酶基因ORF1a和ORF1b。ORF1a翻译产生多蛋白1a(pp1a)，ORF1b编码的多蛋白由核糖体-1移码产生pp1ab。其外包裹一层由膜蛋白(Membrane，M)构成的囊膜；小分子蛋白(Envelope，E)镶嵌于囊膜中；由S1和S2两个亚基组成的梨状的纤突蛋白(Spike，S)在囊膜中铆定并伸展形成突起；核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)与RNA结合形成螺旋对称的核衣壳；同时还有一些附属蛋白。

病毒的反向遗传学操作技术(Reverse genetics)是通过构建病毒的感染性分子克隆，在DNA分子水平上，对病毒进行体外操作，并因此重建相应的病毒及其突变体，用于特征研究，以获得对病毒复制和发病机理基础的见解，同样也是疫苗开发和抗病毒药物筛选不可或缺的工具。然而，冠状病毒反向遗传学具有挑战性，因为它们的基因组相对较大，并且在细菌宿主中繁殖时某些病毒基因组不稳定。因此，冠状病毒反向遗传学常利用非常规方法，如体外拼接，痘苗病毒作为载体或克隆cDNA作为大肠杆菌中的细菌人工染色体进而获得基因组全长cDNA克隆，但是这些方法在体外要对DNA片段进行酶切，拼接等过程，相对比较繁琐。不断出现的RNA病毒带来的持续流行需要一个快速且易于实施的反向遗传学平台，该平台能够可靠地组装病毒基因组，以便快速拯救病毒及其突变体进行特征研究。

授权公告号为CN107190022B的发明公开了一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，该发明基于细菌人工染色体(BAC)系统的冠状病毒反向遗传操作，该系统解决了冠状病毒基因组较大难以构建感染性克隆以及基因组中毒性序列导致cDNA的不稳定性等问题，但是基于BAC的反向遗传操作系统需要在体外进行同源重组，无法一步完成全长基因组的组装(特别是基因组较大的冠状病毒)，需要分步重组，同时还需要在每一段序列的两端分别添加特定的Ⅱ型限制性酶切位点，需要对酶切位点进行精心分析和设计，导致工作繁琐。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的是提供一种快速构建禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法。

本发明的第二目的是提供一种快速构建表达报告基因的鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法；