[发明专利]一种快速构建禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法及其产品和应用

权利要求书

1.一种快速构建禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取禽传染性支气管炎病毒RNA，将RNA转录为cDNA，根据cDNA依次设计n对含有同源臂的引物，扩增得到n个DNA片段，分别命名为F1、F2、……Fn，n≤10；

(2)将启动子添加到F1的5'端，在Fn的3'Ploy(A)尾部引入HB序列；

(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的n个DNA片段和线性化的穿梭质粒转化至酿酒酵母中重组，得到带有重组H120片段的质粒；

(4)将步骤(3)所述的酿酒酵母中带有重组H120片段的质粒在大肠杆菌中进一步扩增；

(5)将步骤(4)进一步扩增的带有重组H120片段的质粒和表达N基因的辅助质粒共转染细胞；

(6)转染后收集上清及细胞混合物，反复冻融，获得P0代病毒液；

(7)将P0代细胞病毒液接种SPF鸡胚，传代，即得禽传染性支气管炎病毒感染性克隆。

2.根据权利要求1所述的一种快速构建禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法，其特征在于，步骤(1)中所述禽传染性支气管炎病毒为IBV H120，全基因组Gene ID为FJ888351。

3.根据权利要求1所述的一种快速构建禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法，其特征在于，所述n为9。

4.根据权利要求1所述的一种快速构建禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法，其特征在于，步骤(2)中所述启动子为CMV，CMV序列如SEQ ID NO：10所示，HB序列如SEQ IDNO：11所示，步骤(5)中N基因序列如SEQ ID NO：13。

5.根据权利要求1所述的一种快速构建禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法，其特征在于，步骤(3)所述穿梭质粒为pYES1L；所述酿酒酵母为MaV203酿酒酵母；步骤(5)所述的细胞为BHK-21细胞。

6.一种快速构建表达报告基因的鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)重复权利要求1步骤(1)；

(2)将步骤(1)5a基因所在的DNA片段中的5a基因替换为报告基因；

(3)重复权利要求1步骤(2)～(7)，即得表达报告基因的鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆。

7.根据权利要求6所述的一种快速构建表达报告基因的禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的方法，其特征在于，步骤(2)中5a基因如SEQ ID NO：14所示，报告基因为eGFP基因，序列如SEQ ID NO：12所示。

8.权利要求1～5任一项方法制得的禽传染性支气管炎病毒克隆或权利要求6～7任一项方法制得的表达报告基因的鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆。

9.权利要求8所述的病毒克隆在制备鸡传染性支气管炎病毒载体疫苗、研究鸡传染性支气管炎病毒基因表达、报告病毒的抗病毒药物筛选方面的应用。

10.一种鸡传染性支气管炎病毒载体疫苗，其特征在于，所述疫苗由权利要求8所述的病毒克隆制成。