[发明专利]一种用于qRT-PCR检测循环microRNAs的氧化石墨烯及其制备方法和用途

说明书

本发明提供了一种用于qRT‑PCR检测循环microRNAs的氧化石墨烯及其制备方法和用途，属于疾病分子诊断领域。本发明提供了一种特定方法制备的氧化石墨烯。采用本发明制备的氧化石墨烯可实现高灵敏度qRT‑PCR检测循环microRNAs表达水平，提供一种用于早期预测乳腺癌患者新辅助化疗反应的方法。与传统qRT‑qPCR相比，本发明方法能够将检测microRNAs的检测限降低10倍。本发明应用基于氧化石墨烯的qRT‑PCR技术，实现了对与乳腺癌患者化疗反应相关的血浆中微量microRNAs的高灵敏度检测，microRNAs表达水平的动态变化有利于对乳腺癌患者的新辅助化疗疗效进行早期预测。该方法具有无创检测的优点，应用前景良好。

技术领域

本发明属于疾病分子诊断领域，具体涉及一种用于qRT-PCR检测循环microRNAs的氧化石墨烯及其制备方法和用途。

背景技术

乳腺癌是最常被诊断的癌症，也是全球女性癌症相关死亡的主要原因。新辅助化疗是对乳腺癌患者进行的一项重要的临床治疗，因为它有助于实现缩小病灶、预防癌症转移、提高保乳手术的概率等目标；它为不能接受I期手术的患者提供了重新获得手术的机会。对新辅助化疗的反应与乳腺癌患者的生存率高度相关，早期预测对新辅助化疗的反应可以促进逐个病人的治疗调整，这将改善病人的结果和生存。

目前，临床上对新辅助化疗疗效的评估主要采用影像学技术和术后组织病理学分析，但这些方法存在敏感性低、主观性和滞后性等局限性。近几年许多研究报道了microRNAs与乳腺癌治疗反应的关系，比如文献《血清microRNA-21和microRNA-125b预测乳腺癌新辅助化疗疗效和预后》(刘利华等，哈尔滨医科大学学报，2020年6月第54卷第3期)研究了血清microRNAs(miRNAs)对乳腺癌新辅助化疗反应和预后的预测价值，研究表明患者血清microRNA-21、microRNA-125b和microRNA-155表达水平在化疗前明显高于健康女性，可以作为乳腺癌新辅助化疗反应和预后的预测标志物；文献《三阴性乳腺癌患者miR-155的表达及在新辅助化疗中的意义》(谢小红等，浙江医学，2017年第39卷第19期)公开了新辅助化疗后microRNA-155表达水平较化疗前明显降低，microRNA-155可作为判断三阴性乳腺癌新辅助化疗疗效及预后的肿瘤分子标志物。可见，现有技术公开了多种microRNAs可用于乳腺癌新辅助化疗反应和预后的预测标志物。但是，大部分microRNAs以低浓度存在，检测较为困难。

目前，许多重要的microRNAs以低浓度存在于生物样品中。微阵列、下一代RNA测序和定量实时荧光PCR(qRT-PCR)可用于检测microRNAs的表达水平。然而，这些方法往往价格昂贵，操作繁琐，灵敏度和特异性低，限制了它们的常规使用。特别是，传统的qRT-PCR对于检测微量的游离核酸的敏感性较低，并产生假阴性结果。因此，使用具有高灵敏度的新型或改进的检测技术，有助于提高microRNAs检测过程的准确性。

氧化石墨烯是石墨烯的氧化衍生物，具有六角形蜂窝结构的sp²区域和与含氧官能团相连的sp³碳基区。以前的研究表明，氧化石墨烯可以通过π-π堆积和氢键吸附单链DNA，而双链DNA碱基被带负电荷的磷酸基团屏蔽，对氧化石墨烯的亲和力很低。基于这一特性，更多的研究表明氧化石墨烯-qPCR在疾病诊断中具有良好的检测性能。进一步将氧化石墨烯用于qRT-PCR，发现引物预先吸附在氧化石墨烯表面可以提高引物-模板杂交的效率，减少非特异性扩增，从而提高qRT-PCR的灵敏度。如公开号为CN113265448A的专利申请公开了一种基于氧化石墨烯提高实时荧光PCR灵敏度和特异性的方法，利用氧化石墨烯可以有效提高PCR技术的灵敏度和特异性，但是利用该专利方法对microRNAs的检出限最低仅为10¹copies/μL，对于很低浓度的microRNAs检测还是存在一定的局限性。

发明内容