[发明专利]一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用，具体涉及免疫生物学领域。包括步骤一，采用超滤浓缩法制备波氏杆菌外膜囊泡；步骤二，采用薄膜分散法结合超声法制备纳米地黄多糖免疫佐剂；步骤三，将制得的波氏杆菌外膜囊泡和纳米地黄多糖免疫佐剂等体积混合后，通过装有聚碳酸酯膜的纳米粒挤压器进行融合，经挤压器来回挤压，即得细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品。本发明采用超滤法制备的了波氏杆菌的外膜囊泡，并将其通过挤压器，反复挤压，与纳米地黄多糖相结合，构建针对波氏杆菌的纳米亚单位疫苗，旨在增强单独外膜囊泡的稳定性，改善其免疫效果。

技术领域

本发明涉及免疫生物学领域，具体涉及一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用。

背景技术

细菌外膜囊泡(outer membranevesicles，OMVs)是由革兰阴性细菌以出芽的方式分离出来的直径为20～300nm的球形双层纳米结构。细菌产生的膜囊泡保留了源细菌的理化特性，但不能再生和复制。

由于OMVs中的膜相关蛋白和毒力因子可诱导细胞产生免疫反应，表明OMVs可以作为免疫原性物质刺激组胞阻止病原体入侵。因此，具有高免疫原性和非复制性的OMVs是疫苗的优良候选者之一。

目前波氏杆菌疫苗都是灭活苗，虽能使机体产生抗体，但持续时间短，保护率低，不能有效抵御再次感染。

发明内容

为此，本发明提供一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用，以解决现有波氏杆菌疫苗持续时间短，保护率低，不能有效抵御再次感染等问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明的第一方面提供一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品的制备方法，包括：

步骤一，采用超滤浓缩法制备波氏杆菌外膜囊泡；

步骤二，采用薄膜分散法结合超声法制备纳米地黄多糖免疫佐剂；

步骤三，将制得的波氏杆菌外膜囊泡和纳米地黄多糖免疫佐剂等体积混合后，通过装有聚碳酸酯膜的纳米粒挤压器进行融合，经挤压器来回挤压，即得细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品。

进一步的，所述超滤浓缩法为先将单个菌落进行扩大培养；再将扩大培养的滤液进行离心、过滤后超滤、浓缩；浓缩液离心后重悬，得波氏杆菌外膜囊泡。

进一步的，所述扩大培养时，培养液中添加头孢氨苄64μg/mL。

进一步的，所述过滤后超滤的条件为过滤是经过0.45μm的滤器；超滤装置的截留分子量为100kDa。

进一步的，所述重悬为TE缓冲液重悬或PBS缓冲液重悬。

进一步的，所述薄膜分散法结合超声法包括：

大豆卵磷脂、胆固醇和DSPE-PEG 2000溶于甲醇和氯仿混合液中，搅拌溶解，减压旋转蒸发除去有机溶剂；

瓶壁形成一层均匀的薄膜后，导入熟地多糖的水溶液，水化后继续旋蒸；瓶壁薄膜完全洗脱，加入ddH2O继续旋转蒸发；

蒸发结束后，利用探头式超声细胞粉碎机进行超声粒径均一化处理，，再将粒径均一化处理的溶液挤压过微孔滤膜，得纳米地黄多糖免疫佐剂。

进一步的，所述探头式超声细胞粉碎机得强度40％，10s开，10s停，工作时间2min。

进一步的，所述聚碳酸酯膜得粒径为200nm。

根据本发明的第二方面提供一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品，是由如上所述方法制备而成。

根据本发明的第三方面提供一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品在制备纳米亚单位疫苗中的应用。