[发明专利]一种高效制备lncRNA编码小肽的多克隆抗体的方法

说明书

本发明涉及一种高效制备lncRNA编码小肽的多克隆抗体的方法，包括以下步骤：（1）对小肽EPC5进行了生物学分析；（2）化学合成EPC5的核苷酸序列并设计引物，PCR扩增后连入载体构建EPC5原核融合表达载体；（3）测序鉴定构建成功的重组质粒转化BL菌种IPTG诱导表达重组蛋白并纯化，SDS‑PAGE检测抗原纯度；（4）以纯化的重组蛋白与佐剂混合后免疫日本大耳兔并在免疫后获取抗血清并通过ELISA检测抗血清效价；（5）纯化抗体，SDS‑PAGE测定抗体纯化浓度，ELISA联合Western Blot探究成品抗体效价，稀释比例和特异性。通过本发明，能够高效制备lncRNA编码小肽的多克隆抗体；为家禽种质资源保护等工作提供新思路。

技术领域

本发明涉及一种高效制备lncRNA编码小肽的多克隆抗体的方法，属于生物技术领域。

背景技术

2018年国家资源普查结果显示我国有18％的畜禽品种面临濒危灭绝危险，且仍有上升趋势，因此寻找有效的资源保护方法，是当前物种资源保护的重要任务。目前生殖细胞、性腺组织冷冻保存与复苏工作以及体细胞克隆等技术可进行哺乳动物的物种资源保护，但是由于生理结构差异，这些技术很难在家禽中应用。而禽类的原始生殖细胞因其具有的种系传递能力和随血液迁移的特点使其可以进行转基因鸡的制备和作为发育生物学模型，同时也为禽类种质资源保护提供新方法。但是在实际应用过程中面临原始生殖细胞数量不足等诸多问题，我的研究聚焦寻找这些问题的解决方法实现原始生殖细胞的具体应用。但是体外获取PGCs数量不足和其种系传递能力低等问题限制了PGCs的实际应用，问题的关键在于对PGCs的发生机制缺乏深入了解，影响其发生的调控因子仍未明确，因此无法建立成熟的体外诱导培养体系。虽然目前科研工作者已经发现一些基因、信号通路、细胞因子以及表观遗传修饰参与PGCs的形成过程，但是这些因素对提高PGCs形成效率和优化体外培养体系并无实质性帮助。为了系统解析PGCs形成过程中的调控机制，我们前期通过转录组测序筛选得到鸡PGCs特异lncRNA(lncBMP4)并证明了lncBMP4对PGCs的发生存在正向调控作用。研究还发现lncBMP4可以编码小肽EPC5，但是缺乏小肽EPC5的特异性抗体导致目前无法深入研究EPC5对PGCs发生的影响。

该技术制备EPC5多克隆抗体并经过ELISA联合Western Blot检测证明抗体可用，为后续深入研究EPC5在PGCs发生过程中的表达规律和调控机制提供材料，以便日后建立成熟的PGCs体外培养和诱导体系，解决体外获取PGCs数量不足等问题。该技术可以应用于lncRNA编码小肽的多克隆抗体制备，为研究lncRNA编码小肽提供实验材料，使得对lncRNA的表达规律和调控机制的探究成为可能，有广泛和深远的应用价值。

多克隆抗体制备技术是重要的人工制备抗体途径，是将抗原物质通过不同途径注入动物体内，经数次免疫后采取动物血液，分离出血清，由此获得抗血清，即多克隆抗体。该技术能够短期内为研究目的蛋白的检测和定位等过程提供大量抗体且具制备简便、反应强度高等优点。pET载体系统是目前应用最广泛的抗原表达系统，是将克隆有目的基因的pET载体转化进入感受态原核表达菌株，经过IPTG诱导、纯化获得目的蛋白而后进行动物免疫。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是非编码RNA家族中长度超过200个核苷酸的RNA，起初被认为不具备编码蛋白质的能力，但随着相关研究的不断开展，陆续有研究报道lncRNA可以编码小肽进而发挥生物学功能，然而缺乏lncRNA编码小肽的特异性抗体阻碍了对小肽表达规律及调控功能等进行深入研究。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中所存在问题，提供一种高效制备lncRNA编码小肽的多克隆抗体的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种高效制备lncRNA编码小肽的多克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对小肽EPC5进行了生物学分析；

(2)化学合成EPC5的核苷酸序列并设计引物，PCR扩增后连入载体构建EPC5原核融合表达载体；