[发明专利]一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测CRISPR‑Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用。本发明所述报告细胞系将纳米荧光素酶基因Nluc与管家基因ACTG1融合表达，避免了细胞内环境变化对纳米荧光素酶Nluc活性的影响；通过Nluc活性的变化反映CRISRP‑Cas蛋白的切割活性，克服了现有GFP的半衰期较长，没有办法快速响应基因位点双链断裂的情况的不足。此外，本发明所述报告细胞系还可用于筛选CRISPR‑Cas蛋白抑制剂。本发明利用构建所得报告细胞系筛选到了能够在细胞内抑制SpCas9切割活性的小分子化合物，筛选过程的操作简单，检测方便，信号稳定。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用。

背景技术

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是原核生物基因组内的一段重复序列。为了将病毒的外来入侵基因清除，细菌进化出了CRISPR-Cas系统，以此抵抗病毒的浸染。CRISPR-Cas系统存在于大多数细菌与所有的古菌中，自其被发现以来，CRISPR-Cas系统在临床应用、基础研究或者分析检测方面都体现出了极大的前景。

为了更好地利用CRISPR-Cas系统，优化CRISPR-Cas系统，提高Cas蛋白的活性和递送是当前的研究热点。另由于CRISPR-Cas蛋白的额外活性，在对靶位点编辑的同时会对其他基因位点进行编辑，造成脱靶。因此，开发CRISPR-Cas蛋白的调节剂用于控制CRISPR-Cas蛋白的活性，以提高该系统的安全性也是需要关注的方向。

深度测序虽然可以比较精确的显示CRISPR-Cas蛋白的编辑效率，但是该方法的操作复杂。绿色荧光蛋白(GFP)报告系统被广泛应用于蛋白定位追踪和高通量药物筛选，具有检测方便、价钱便宜等优点。目前，基于荧光蛋白的报告系统也被应用于评估CRISPR系统的活性；当GFP基因被编辑以后，GFP蛋白表达下降，荧光信号减弱，从而可以评价CRISPR系统的活性。但是GFP在细胞里面的半衰期较长，检测到显著的GFP荧光猝灭至少需要2天，没有办法快速响应基因位点双链断裂的情况。同时，由于CRISPR-Cas蛋白对靶位点的切割比较快，例如，SpCas9在1天左右就基本对靶位点完成了切割，至少50％的靶向切割发生在6小时内，而基于荧光蛋白的报告细胞难以快速、高效评估CRISPR-Cas蛋白的切割活性。因此，为了评估CRISPR-Cas系统在细胞里面的切割活性，需要建立灵敏、快速精确的高通量检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系的制备方法。

本发明的第二个目的是提供用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。

本发明的第三个目的是提供所述细胞系在检测CRISPR-Cas蛋白切割活性、评估CRISPR-Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或筛选CRISPR-Cas蛋白调控剂中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述细胞系在制备检测CRISPR-Cas蛋白切割活性、评估CRISPR-Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或筛选CRISPR-Cas蛋白调控剂的产品中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的方法。

本发明的第六个目的是提供雷公藤红素、二氢丹参酮I、10-羟基喜树碱、盐酸拓扑替康中的任意一种或几种在抑制SpCas9活性或制备抑制SpCas9的抑制剂中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：