[发明专利]一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用

权利要求书

1.一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.在所用报告细胞的管家基因的终止密码子前插入绿色荧光蛋白与分泌型纳米荧光素酶的融合表达基因，筛选成功定点插入融合表达基因的单克隆细胞；

S2.利用带筛选标记的慢病毒载体将萤火虫荧光素酶基因随机插入步骤S1所得单克隆细胞的基因组，筛选含萤火虫荧光素酶活性的单克隆细胞，培养得到用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述报告细胞为HEK293细胞，所述管家基因为ACTG1。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述绿色荧光蛋白为增强型的绿色荧光蛋白，所述纳米荧光素酶的N端含有分泌信号肽，绿色荧光蛋白和纳米荧光素酶之间含有可以剪切的linker。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2利用带嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因的慢病毒载体将萤火虫荧光素酶基因随机插入步骤S1所得单克隆细胞的基因组，用嘌呤霉素筛选含萤火虫荧光素酶活性的单克隆细胞。

5.权利要求1～4任一所述制备方法制备所得用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。

6.权利要求5所述细胞系在检测CRISPR-Cas蛋白切割活性、评估CRISPR-Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或筛选CRISPR-Cas蛋白调控剂中的应用。

7.权利要求5所述细胞系在制备检测CRISPR-Cas蛋白切割活性、评估CRISPR-Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR-Cas蛋白突变体或筛选CRISPR-Cas蛋白调控剂的产品中的应用。

8.一种检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的方法，其特征在于，所述方法为：将表达CRISPR-Cas蛋白和靶向绿色荧光蛋白sgRNA的质粒或者CRISPR-Cas蛋白/靶向绿色荧光蛋白sgRNA复合物转染进权利要求6所述细胞系，同时转染CRISPR-Cas蛋白和非靶向绿色荧光蛋白sgRNA的质粒或蛋白/非靶向绿色荧光蛋白sgRNA复合物作为对照，将转染所得细胞孵育后，检测纳米荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性，计算CRISPR-Cas蛋白切割效率。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，在检测纳米荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性时，纳米荧光素酶活性用萤火虫荧光素酶活性进行校正，校正后的酶活性为：相对荧光强度＝纳米荧光素酶活性/萤火虫荧光素酶活性×校正因子；所述校正因子为任一常数；

CRISPR-Cas蛋白切割效率＝[(电转非靶向sgRNA组相对荧光强度)-(电转靶向sgRNA组相对荧光强度)]/(电转非靶向sgRNA组相对荧光强度)×100％。

10.雷公藤红素、二氢丹参酮I、10-羟基喜树碱、盐酸拓扑替康中的任意一种或几种在抑制SpCas9活性或制备抑制SpCas9的抑制剂中的应用。