[发明专利]一种酪蛋白磷酸肽的提取纯化方法

说明书

本发明提供了一种酪蛋白磷酸肽的提取纯化方法，本发明属于酪蛋白磷酸肽制备技术领域。本发明提供的一种酪蛋白磷酸肽的提取纯化方法，包括如下步骤：(1)牦牛乳酪蛋白溶液中加入0.8～1.2％的胰蛋白酶酶解，得到酶解牛乳酪蛋白；(2)酶解牛乳酪蛋白中依次加入钙离子和乙醇溶液，静置沉淀酪蛋白磷酸肽，得到粗酪蛋白磷酸肽；(3)粗酪蛋白磷酸肽使用201×7阴离子交换树脂纯化，盐酸洗脱，得到提纯的酪蛋白磷酸肽。本发明筛选出胰蛋白酶对牦牛乳酪蛋白进行酶解，采用钙乙醇沉淀法对酶解液中的CPP沉淀，通过采用强碱性阴离子树脂纯化CPP，得到的纯化CPP的氮磷比为6.81，P的回收率为95.5％。

技术领域

本发明涉及酪蛋白磷酸肽制备技术领域，尤其涉及一种酪蛋白磷酸肽的提取纯化方法。

背景技术

牦牛是藏区的标志性象征，是高原地区特色畜产品，可以在高海拔(2500-5000m)，强紫外线，缺氧及低温等极端恶劣的环境中生存，因其独特的生态学特征使其具有较高的经济价值，享有高原之舟的美誉，为牧民提供肉、乳、毛、革等基本生产及生活物资，是牧民们生存的保障。

牦牛乳的总蛋白质含量中有80％是酪蛋白(Casein，CN)，是蛋白质中相当重要的一部分，是普通牛乳的1.5倍，其中αs-CN含量比牛乳低，β-CN含量比牛乳高，κ-CN含量与牛乳相近，β-CN较其他酪蛋白更好被人体消化吸收，是婴幼儿的理想蛋白质，在藏区常牦牛乳常用来哺育婴幼儿。

生物活性肽(Bioactive peptides，BAPs)是酶解蛋白质得到的一类多肽，在蛋白质结构中不表现生物活性，只有经酶解游离后才能表现出特定生物活性。BAPs的来源丰富，较蛋白质有更短的氨基酸序列，因此帮助人更好的消化吸收，以此满足人体正常生命活动的基本要求，表现出某些特殊药用特性及营养活性，例如降血压、抗氧化、抗菌、免疫调节等。因其潜在的健康益处，可以被完整吸收且较相同组成的氨基酸有更快的吸收速度等特点，成为现在研究的热点内容。它们被定义为“对身体功能或状况有积极影响并最终影响健康的特定蛋白质片段”。食物及饲料蛋白源活性肽研究近年来广受重视，近年来，食物及饲料蛋白源活性肽研究受到了广泛的关注，通常研究团队采用蛋白消化等方法，从食物及饲料中分离识别出许多具有生理活性的多肽。

生物活性肽表现出多种生物活性，钙作为机体必不可缺的高含量矿物质元素，对人体健康有着重要作用。钙离子在人体肠道吸收运作机制有主动跨细胞转运机制(Transient receptor potential cation channel subfamily V6)钙离子通道和被动旁细胞转运机制两种。其中TRPV6钙离子通道转运机制主要分为三部分：TRPV6蛋白经激活将肠道中钙离子转运至小肠细胞细胞质中，进一步与细胞质中的钙转运蛋白(CalbindinD9K)结合，最终大部分钙离子被细胞膜钙泵(PMCA1b)蛋白泵出小肠细胞进入血液。被动旁细胞运转方式是钙离子通过肠道上皮细胞间隙，受pH、钙离子浓度梯度、蛋白激酶C、丝氨酸-苏氨酸或其他激素因子等因素调控吸收。

磷酸肽具有特殊负电荷结构，对与金属离子结合有着显著作用。其中牛乳中提取的酪蛋白磷酸肽(CPP)作为磷酸肽补钙制剂对促钙吸收活性已经被广泛研究。研究人员认为，CPP可以促进人体对钙吸收，可能是因为可以与Ca²⁺结合得到可溶性复合物。CPP-Ca在肠道中与细胞质膜形成跨膜离子通道运送钙离子。也有研究表明钙肽复合物是一小肽为钙运转的载体，通过小肽转运途径被整体转运至细胞内，TRPV6钙离子通道和1,25-二羟基维生素D3对钙吸收的促进并没有帮助。