[发明专利]一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建和应用

说明书

本发明公开了一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建和应用，属于分子生物学技术领域。本发明通过在pLCAG‑EGFP慢病毒空载体的BamH1和AgeI酶切位点处插入ZXDC基因的转录活性区域及CIITA结合区域构建得到如图1所示的pLCAG‑ZXDC‑EGFP过表达慢病毒载体，再将其与慢病毒包装质粒共同转染宿主细胞得到ZXDC高表达的重组慢病毒，能够感染小胶质细胞并能调控炎症因子的表达。本发明的构建方法不仅实现了ZXDC的高表达，也为后续研究ZXDC的功能提供了一个良好的实验工具，有利于进一步研究ZXDC在中枢神经系统中的功能，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建和应用。

背景技术

ZXDC(zinc finger,X-linked,duplicated family member C)是一个转录调控因子，含有十个锌指结构、一个相对有效的转录激活域和C端的CIITA结合域，其中转录激活域是转录调控所必需的，而锌指结构是非必需的。ZXDC能和ZXDA形成转录活性复合物后与CIITA相结合，并参与主要组织相容性复合体MHCII基因表达的调节，ZXDC与CIITA结构中含有富含亮氨酸重复序列的区域相互作用，ZXDC的过表达导致CIITA超激活，而ZXDC表达的沉默则降低了CIITA的转录活化能力。此外，ZXDC还调节参与髓细胞分化和炎症的基因，包括趋化因子CCL2等，过表达ZXDC在293细胞系中可显著改变多种基因的表达水平，这些基因控制着细胞周期、细胞增殖和分化等细胞行为，其中EGR2、BDNF、CDKN1C和IL5Ra基因显著上调，因此，ZXDC对于调控免疫微环境十分重要。虽然ZXDC在大脑中表达显著，但是其在中枢神经系统中的作用尚未有报道。小胶质细胞是在中枢神经系统中与免疫密切相关的细胞，在衰老或者刺激下小胶质细胞被长期激活，会分泌TNF、IL1β、IL6和活性氧或活性氮(ROS/NOS)等炎症因子而产生神经损伤，同时激活的小胶质细胞MHC-Ⅱ的表达增加。因此，研究ZXDC对于小胶质细胞炎症因子的释放具有重要意义。

慢病毒载体(Lentiviral vectors)来源于单链RNA逆转录病毒HIV-1，由于其感染非分裂细胞、有效整合到宿主基因组、携带大的转基因并具有稳定的长期转基因表达的能力，而被广泛用作中枢神经系统中的基因转移工具。目前，慢病毒载体已被证明能转导中枢神经系统内的大多数细胞类型，并在用于体外纠正基因缺陷的临床试验中已证明其在许多神经遗传疾病中有效。因此，如果能设计一种过表达ZXDC的慢病毒载体，则有利于研究ZXDC在中枢神经系统中的作用。

发明内容

为了解决目前ZXDC在中枢神经系统中的作用尚未涉及的问题，本发明通过将ZXDC的转录激活域和CIITA结合域的序列插入慢病毒载体的BamH1和AgeI酶切位点构建了一种重组慢病毒载体质粒，实现了ZXDC在小胶质细胞中的高表达，同时ZXDC的高表达可以调控小胶质细胞中炎症因子的表达，有利于后续研究ZXDC在中枢神经系统中的作用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种过表达ZXDC慢病毒载体的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

S1：通过PCR扩增如SEQ ID NO.1所示的两端含有BamH1酶切位点和AgeI酶切位点的ZXDC转录激活域及CIITA结合区域得到PCR扩增产物；

S2：双酶切pLCAG-EGFP慢病毒空载体；

S3：将步骤S1制得的扩增产物与步骤S2双酶切后的pLCAG-EGFP慢病毒空载体进行连接后得到重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP，重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP再经转化、挑取单克隆扩增培养、提取质粒后测序验证；

S4：验证步骤S3测序正确的重组产物pLCAG-ZXDC-EGFP的表达情况，验证正确的即为过表达ZXDC慢病毒载体。