[发明专利]一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法

说明书

本发明涉及一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法，通过采用细胞工厂和生物反应器相结合的方法进行细胞培养，简化了操作步骤，减少了培养空间的占用，同时降低了培养时间，从而提高了培养效率，降低了培养成本；同时本发明所采用的方法传代培养效率高，且批间一致性较好，使用相对规模设备和空间即可达到2000L到4000L上清液生产规模。

技术领域

本发明涉及生物医药生产技术领域，尤其是涉及一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法。

背景技术

溶栓治疗是使用药物使血栓溶解，达到血管再通的目的，从而使受阻的血管灌流区域的脑组织重新获得血氧供应。由于纤维蛋白是血栓的一个重要成分，所以，目前主要使用溶解纤维蛋白的药物，进行溶栓治疗。注射用替奈普酶是最新一代溶栓药物，由于其能特异地与血栓中的纤维蛋白结合，达到局部溶栓，而对血液中的纤维蛋白原、凝血因子等破坏作用较小，克服了早期溶栓药物链激酶、尿激酶等由于激活全身纤溶系统所带来的潜在的出血危险。同时本品还具有高度的纤维蛋白特异性，能显著减少溶栓时的出血不良反应；且其半衰期长，仅需单次静脉推注给药即可，使用方便，可用于入院前急救。

注射用替奈普酶在生产过程中离不开CHO细胞培养技术，目前常用的CHO细胞培养工艺主要有两种：一种是在培养皿中通过贴壁方式小规模、手动的进行细胞培养，如市面上常见的corning公司的pe包被塑料培养皿，该装置具有生产成本低、操作简便、细胞生长状态稳定等特点；另一种是近年来在上述技术的基础上开发的可进行贴壁细胞规模化扩增的细胞工厂，其也被广泛应用于疫苗生产、抗体制备等研究和应用领域；然而，在实际生产中上述两种细胞培养方式都存在一定的不足，其中培养皿空间利用率低、人工操作效率低的缺点导致其无法进行大规模应用，而细胞工厂中的细胞难以进行观测和调整，导致其生长过程中易出现细胞分布不均，单位面积细胞产率明显低于培养皿。

因此，有必要提供一种新的技术方案以克服上述缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可有效解决上述技术问题的CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法；该方法工艺稳定，传代培养效率高，且批间一致性较好，占地面积小，成本低，可以进行规模化生产。

为达到本发明之目的，采用如下技术方案：

一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法，包括如下步骤：

步骤1：取工作细胞，进行水浴解冻，得到细胞液；而后将细胞液加入含有预热复苏培养基的离心管中进行离心，5-7min后，弃上清液，在离心管中加入复苏培养基重新悬浮细胞，得到细胞悬浮液；

步骤2：将所述细胞悬浮液接种至方瓶中进行复苏培养，待方瓶内复苏的细胞贴壁率达到90％以上后，将复苏的细胞接种至细胞工厂内进行扩增培养；待所述细胞工厂内细胞悬液中活细胞数量达到6-10x10⁹个后，收集细胞悬液将其接种至生物反应器内进行灌流培养；

步骤3：调整生物反应器的培养参数，而后在生物反应器内灌流罐扩增培养基，进行灌流培养，待所述生物反应器内的葡萄糖消耗量达到要求时，将罐扩增培养基置换为罐收获培养基，进行灌流培养并进行培养上清液的收获。

优选的，所述步骤1中，水浴解冻的温度为37-40℃。

优选的，所述步骤2中，进行扩增培养的过程中，依次使用一套1-3层、10-13层、40-50层的细胞工厂培养瓶进行逐级放大培养。

优选的，所述步骤2中，进行扩增培养过程中所使用的扩增培养基为IMDM液体培养基，其组分为4-10％DFBS、1-3x10^-6MMTX、2-4g/L碳酸氢钠。

优选的，所述步骤3中，所述生物反应器为固定床式生物反应器，其内部聚酯片装量为800-1500g。