[发明专利]一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法

权利要求书

1.一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1：取工作细胞，进行水浴解冻，得到细胞液；而后将细胞液加入含有预热复苏培养基的离心管中进行离心，5-7min后，弃上清液，在离心管中加入复苏培养基重新悬浮细胞，得到细胞悬浮液；

步骤2：将所述细胞悬浮液接种至方瓶中进行复苏培养，待方瓶内复苏的细胞贴壁率达到90％以上后，将复苏的细胞接种至细胞工厂内进行扩增培养；待所述细胞工厂内细胞悬液中活细胞数量达到6-10x10⁹个后，收集细胞悬液将其接种至生物反应器内进行灌流培养；

步骤3：调整生物反应器的培养参数，而后在生物反应器内灌流罐扩增培养基，进行灌流培养，待所述生物反应器内的葡萄糖消耗量达到要求时，将罐扩增培养基置换为罐收获培养基，进行灌流培养并进行培养上清液的收获。

2.根据权利要求1所述的一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法，其特征在于：所述步骤1中，水浴解冻的温度为37-40℃。

3.根据权利要求1所述的一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法，其特征在于：所述步骤2中，进行扩增培养的过程中，依次使用一套1-3层、10-13层、40-50层的细胞工厂培养瓶进行逐级放大培养。

4.根据权利要求3所述的一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法，其特征在于：所述步骤2中，进行扩增培养过程中所使用的扩增培养基为IMDM液体培养基，其组分为4-10％DFBS、1-3x10^-6MMTX、2-4g/L碳酸氢钠。

5.根据权利要求1所述的一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法，其特征在于：所述步骤3中，所述生物反应器为固定床式生物反应器，其内部聚酯片装量为800-1500g。

6.根据权利要求5所述的一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法，其特征在于：所述步骤3中，生物反应器的培养参数为：Temp 37±1℃、Agit 90～120rpm、pH7.10～7.40、DO30％～90％、Gas 0.4～5.0SLPM。

7.根据权利要求1或6所述的一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法，其特征在于：所述步骤3中，所述罐扩增培养基为无血清培养基，其组分为1-3g/L碳酸氢钠、1.5-2.5g/L葡萄糖、2-5％DFBS、1-3x10^-6MMTX。

8.根据权利要求7所述的一种CHO细胞贴壁连续灌流罐培养方法，其特征在于：所述步骤3中，所述罐收获培养基为无血清培养基，其组分为1-3g/L碳酸氢钠、1.5-2.5g/L葡萄糖、2-5％DFBS、2-4mg/L抑肽酶。