[发明专利]一种SINV感染性载体及其在制备抗肿瘤药物中的应用

说明书

本发明公开了一种SINV感染性载体及其在制备抗肿瘤药物中的应用，所述SINV感染性载体以pSINV为骨架载体，在所述骨架载体上连接有粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子GM‑CSF。本发明的SINV感染性载体能够更加稳定地表达插入的外源基因，且病毒生物学特性与野生型相比无显著性差异；本发明的SINV病毒颗粒能够在宫颈癌Hela肿瘤细胞和肝癌Hep3B肿瘤细胞内复制、选择性地感染肿瘤细胞，并在免疫缺陷小鼠模型中实现对肿瘤的杀伤作用，对于宫颈癌和肝癌的溶瘤治疗等应用性研究和基础性研究具有重要的现实意义和广泛的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种SINV感染性载体及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

目前针对癌症治疗的传统技术手段主要是手术治疗、化疗、放疗等，这些方法虽然能在一定程度上控制肿瘤生长，但也存在一定的局限性。手术治疗往往不能完全清除肿瘤细胞，术后伤口愈合的反应还可能导致转移性肿瘤的生长；放疗和化疗容易引起肿瘤细胞的耐受和复发，导致预后不良。因此，迫切需要用于癌症治疗的新策略。

溶瘤病毒疗法作为一种新型的肿瘤细胞生物疗法，为恶性肿瘤的治疗带来了新的发展希望。溶瘤病毒能够选择性杀死肿瘤细胞，而对正常的组织和细胞无损伤作用。溶瘤病毒除了自身的杀伤肿瘤作用，还可以携带多种外源基因，实现生物调控作用，并且溶瘤病毒还可以诱导局部和全身的特异性抗肿瘤免疫，触发机体内获得性免疫反应和适应性免疫反应。

辛德毕斯病毒(Sindbis virus，SINV)属于披膜病毒科、甲病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb，共编码5个结构蛋白(capsid、E3、E2、6K和E1)和4个非结构蛋白(NSP1、NSP2、NSP3和NSP4)。辛德毕斯病毒在自然界中主要是通过蚊虫叮咬在脊椎动物，如鸟类、哺乳动物中进行传播，具有广泛的宿主范围，包括人、鼠、猴等，这种感染特性可以使其成为介导外源基因到宿主体内的载体。在肿瘤细胞内复制、选择性地感染肿瘤细胞继而杀死肿瘤细胞的溶瘤病毒疗法是目前最有希望的肿瘤免疫治疗方法之一。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种稳定表达GM-CSF的SINV感染性载体及其病毒颗粒和应用，并评估该病毒颗粒在宫颈癌Hela小鼠皮下肿瘤模型和肝癌Hep3B小鼠皮下肿瘤模型中的效果。本发明在辛德毕斯病毒的NSP1基因中引入突变——在NSP1基因的853号核苷酸序列由G突变为A，相应的285号氨基酸序列由Gly突变为Ser，引入突变可以增加外源基因插入的稳定性。本发明利用突变后的辛德毕斯病毒感染性载体转染细胞成功制备出能够更加稳定表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的辛德毕斯病毒颗粒，并成功应用于宫颈癌Hela小鼠模型和肝癌Hep3B小鼠模型的溶瘤治疗。

本发明提供一种稳定表达GM-CSF的SINV感染性载体，所述SINV感染性载体以pSINV为骨架载体，在所述骨架载体上连接有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF；所述SINV感染性载体上依次连接有UBC启动子、5’UTR、NSP1基因的核苷酸序列、NSP2基因的核苷酸序列、NSP3基因的核苷酸序列、NSP4基因的核苷酸序列、C基因的核苷酸序列、E3基因的核苷酸序列、E2基因的核苷酸序列、6K基因的核苷酸序列、E1基因的核苷酸序列、GM-CSF基因的核苷酸序列、3’UTR。

进一步的，所述NSP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

进一步的，所述SINV感染性载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

本发明还提供一种辛德毕斯病毒颗粒的制备方法，使用所述的SINV感染性载体转染细胞。

进一步的，所述细胞为BHK-21细胞。

本发明还提供一种辛德毕斯病毒颗粒，由所述的SINV感染性载体转染细胞后制备得到。

本发明还提供所述的辛德毕斯病毒颗粒在制备治疗宫颈癌药物中的应用。