[发明专利]基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种中的应用

权利要求书

1.一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白，其特征在于，所述AhALS2突变型蛋白包括Ah10ALS2突变蛋白或/和Ah20ALS2突变蛋白；

Ah10ALS2突变蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6～8；

Ah20ALS2突变蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸、或苯丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9～10。

2.一种编码权利要求1所述AhALS2突变型蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，SEQ ID NO：6～8所示的Ah10ALS2突变蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示；SEQ ID NO：9～10所示的Ah20ALS2突变蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～5所示。

4.如权利要求2或3所述的编码AhALS2突变型蛋白的基因在花生育种中的应用。

5.利用如权利要求2或3所述的编码AhALS2突变型蛋白的基因建立抗苯磺隆类除草剂花生新种质的方法。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)sgRNA靶点的确定：

sgRNA靶点覆盖Ah10ALS2基因的第574位碱基和Ah20ALS2基因的第562位碱基，靶点序列3′端为PAM序列，所述靶点序列为5’-CAGGTCCCCCGCCGCATGATTGG-3’；

(2)制备oligo二聚体：

设计oligo序列引物Target-Sense和Target-Antisense，引物离心后，分别将引物用去离子水稀释至浓度为10μM，各取1μL，加入18μL退火缓冲液，混匀；95℃保持3min后，以0.2℃/秒降温速度缓慢降至20℃，在此温度下保持5min，加水稀释至100μL，完成oligo二聚体的制备；

(3)CRISPR-Cas9重组载体的构建：

选用pCSGAP01载体，加入bsal内切酶1μL，bsal内切酶的buffer缓冲液5μL，加水补齐至50μL，37℃酶切1h；回收酶切后的线性化载体2μL及infusion Enzyme Mix 1μL，加入合成的oligo二聚体1μL，在25℃反应1h；将连接后的载体转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆载体进行质粒测序，保存测序正确的阳性菌斑，得到CRISPR-Cas9重组载体质粒；

(4)花生的遗传转化：

以花生种子的胚芽为外植体，通过诱导获得胚性愈伤，用基因枪轰击法进行花生的遗传转化，经过潮霉素抗性筛选，获得再生抗性愈伤，经过成苗诱导，获得再生花生幼苗。

(5)突变植株鉴定：

鉴定再生花生幼苗植株是否发生预期位点的突变，保留突变株系，丢弃非突变株系；

(6)抗苯磺隆类除草剂的花生新种质的获得：

选择纯合突变或双等位突变的编辑植株进行繁殖，收获下一代种子，即为抗苯磺隆类除草剂花生新种质。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物Target-Sense和Target-Antisense的序列为：

Target-Sense：5'-TGTGTCAGGTCCCCCGCCGCATGAT-3'；

Target-Antisense：5'-AAACATCATGCGGCGGGGGACCTG-3'。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述质粒测序的引物序列为pCBSG-seq:5’-TCCCAGTCACGACGTTGTAA-3’。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述预期位点为Ah10ALS2基因的核苷酸序列的第574位发生C→T突变，或第574-575位发生CC→TT或CC→AA突变；或/和，Ah20ALS2基因的核苷酸序列的第562位发生C→T突变或第562-563位发生CC→TT突变。