[发明专利]一种生产5-羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种生产5‑羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用，所述基因工程菌在原有5‑HTP工程菌株的基础上，应用了一种异源表达活性高、毒性低的色氨酸羟化酶突变体，构建了更加高效的色氨酸羟化途径；同时通过适度表达异源来源于Exiguobacterdium sibiricum的葡萄糖脱氢酶(GDHsubgt;esi/subgt;)途径，构建了NAD(P)H再生途径，最终大幅提高了工程菌株的5‑HTP产量，并有效降低了中间体L‑Trp的积累浓度，得到了一株遗传背景清晰、能通过微生物直接发酵法高效稳定生产5‑HTP的基因工程菌，具有良好的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术生产领域，尤其是一种生产5-羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-5-hydroxytryptophan(5-HTP)是一种非蛋白质氨基酸，是多种重要生理功能分子的前体，例如神经递质血清素(又称5-hydroxytryptamine，5-HT)和激素褪黑素等。5-HTP已被证明在治疗抑郁症、失眠、帕金森综合征和阿尔兹海默症等诸多疾病方面具有显著疗效，这也使其在医药、保健品等领域的应用不断得到扩展，商业潜力得到持续挖掘。

目前，商业上的主流5-HTP生产方法仍然是植物种子提取法。然而，该法所使用的原材料Griffonia Simplifolia种子需要从非洲进口，这在很大程度限制了产能的扩增，导致5-HTP市场价格居高不下。此外，化学法虽也有研究，但因其复杂的过程、高昂的底物成本等因素，导致其在经济上并不可行。可见，传统生产方法已经不能满足日益增长的市场需求，因此需要一种更实用的方法来提供更高更稳定的产能。而微生物发酵作为一种高效、低成本、可持续且环境友好的生产技术，已被应用到许多有价值天然分子的大规模工业化生产中，无疑是生产5-HTP更可行的选择。

近年来，经过研究者们的不懈努力，5-HTP微生物细胞工厂的开发取得了从无到有的突破。但是，高效5-HTP工程菌的构建仍然面临着诸多瓶颈，如异源羟化酶在原核底盘细胞中的低活性和低可溶性，以及前体物L-Trp的大量盈余等，这些问题导致现有的生产菌株均难以满足实际生产应用的要求。而考虑到大规模5-HTP生产的经济可行性，构建能够稳定地获得高效价、高纯度5-HTP，且低L-Trp残留的高效微生物细胞工厂尤为关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种生产5-羟基色氨酸的基因工程菌。

本发明所要解决的技术问题在于提供上述生产5-羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法。

本发明所要解决的技术问题在于提供上述生产5-羟基色氨酸的基因工程菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种生产5-羟基色氨酸的基因工程菌，命名为HTP12(为经人工改造的、具有特定基因型的大肠杆菌)，以5-HTP工程菌株HTP10(CN113549588A)为基础，在工程菌HTP10基因组mbhA-TPH150位点整合了一个由M1-30启动子驱动的gdh_esi基因；向其细胞中电转化入重组质粒pSTV-TM2。

上述生产5-羟基色氨酸的基因工程菌通过引入异源羟化活性更高的色氨酸羟化酶突变体TM2，替代了原有的羟化酶突变体TPH150(提高工程菌株胞内羟化反应效率，构建更加高效的色氨酸羟化模块)；引入来源于Exiguobacterdium sibiricum的葡萄糖脱氢酶(GDH_esi)途径，有效再生两种还原型辅因子NAD⁺和NADP⁺(间接强化了胞内色氨酸羟化反应，显著提高5-HTP的产量，并降低中间体L-Trp的盈余)。所述GDH_esi和TM2基因均为经密码子优化后人工合成。

上述生产5-羟基色氨酸的基因工程菌于-80℃冰箱保存即可。