[发明专利]一种生产5-羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种生产5-羟基色氨酸的基因工程菌，其特征在于：命名为HTP12，以5-HTP工程菌株HTP10为基础，在工程菌HTP10基因组mbhA-TPH150位点整合了一个由M1-30启动子驱动的gdh_esi基因；向其细胞中电转化入重组质粒pSTV-TM2。

2.根据权利要求1所述的生产5-羟基色氨酸的基因工程菌HTP10，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli W3110，保藏号ATCC 273250。

3.根据权利要求1所述的生产5-羟基色氨酸的基因工程菌HTP10，其特征在于：所述gdh_esi基因具有SEQ ID No.4所示序列，编码来源于Exiguobacterdium sibiricum的葡萄糖脱氢酶。

4.根据权利要求1所述的生产5-羟基色氨酸的基因工程菌HTP10，其特征在于：所述M1-30启动子为中等强度启动子，具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的生产5-羟基色氨酸的基因工程菌HTP10，其特征在于：所述重组质粒pSTV-TM2，是以质粒pSTV28为载体构建得到的，所述质粒pSTV28具有SEQ ID No.3所示核苷酸序列，该pSTV28为中拷贝质粒，具有p150A复制起始位点,所述重组质粒pSTV-TM2携带有色氨酸羟化酶突变体TM2基因，TM2基因具有SEQ ID No.1所示序列，由T7启动子驱动表达，编码色氨酸羟化酶突变体TM2，所述T7启动子具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列。

6.权利要求1所述生产5-羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)为了构建NAD(P)H再生模块并敲除原有的TPH150基因，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli HTP10基因组进行定向改造，将M1-30启动子驱动的gdh_esi基因整合于HTP10基因组的mbhA-TPH150位点，得到菌株HTP11；

(2)为了实现色氨酸羟化酶突变体基因TM2的高效表达，利用II OneStep Cloning Kit试剂盒，以中拷贝质粒pSTV28作为线性载体，克隆由T7启动子引导表达的TM2基因，构建质粒pSTV-TM2，并将其电转入工程菌HTP11中，最终得到菌株HTP12。

7.权利要求1所述生产5-羟基色氨酸的基因工程菌在发酵产5-羟基色氨酸方面的应用。

8.根据权利要求7所述的生产5-羟基色氨酸的基因工程菌的应用，其特征在于：能够以葡萄糖为底物，稳定高效地合成5-羟基色氨酸。

9.根据权利要求7所述的生产5-羟基色氨酸的基因工程菌的应用，其特征在于：发酵罐分批补料发酵具体方法如下：将菌种活化后，制备种子液，当OD₆₀₀达到12-15时，保留600mL种子培养物，并立即添加新鲜发酵培养基，使发酵液终体积为3L；初始通气量、初始搅拌转速、pH、温度和溶氧等条件参数控制方式均与种子培养相同；在发酵开始时一次性加入终浓度为5g/L的木糖，诱导受T7启动子驱动的基因表达；底物葡萄糖消耗完后，根据DO反馈补料策略，流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液，使发酵过程中葡萄糖浓度始终维持在2g/L以下。

10.根据权利要求9所述的生产5-羟基色氨酸的基因工程菌的应用，其特征在于：所述分批补料发酵中采用的培养基组成和处理方式为：葡萄糖20-40g/L，酵母浸出粉2-5g/L，硫酸铵1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，无水硫酸镁0.5-2g/L，七水硫酸亚铁30-60mg/L，一水硫酸锰20-40mg/L，V_H 0.1-0.5mg/L，V_B1 0.1-0.5mg/L，微量元素混合液1-2mg/L，115℃灭菌15min。