[发明专利]一种融合蛋白CRM197及其制备方法

说明书

本发明公开了一种融合蛋白CRM197及其制备方法，它包括包含以下步骤：S1：全基因合成融合蛋白的DNA序列；S2：通过基因工程技术连接目的片段与载体，获得含编码所述融合蛋白的DNA序列的重组大肠杆菌表达载体；S3：将步骤S2所述的重组大肠杆菌表达载体转化到大肠杆菌感受态中，经测序成功后，将所述质粒转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白；S4：对筛选高产菌株进行高密度发酵，经过酶切、第一步纯化和第二步二步纯化获取高纯度天然CRM197蛋白。本发明解决了市售天然CRM197的低产量和高成本对其应用造成了极大限制，在疫苗生产上具有广阔前景。

技术领域

本发明属于基因工程制药领域，更具体的说，使用促溶标签技术纯化载体蛋白，可应用在疫苗制造领域。

背景技术

白喉毒素（Diphtheria toxin）是β噬菌体将白喉杆菌溶源化后，其tox基因编码表达的外毒素。由535个氨基酸组成，分子量为58kD的多肽。分为N端催化区(1～193)、穿膜区(205～378)、 C端受体结合区(386～535)。具有ADP-核糖转移酶活性，通过使真核细胞肽链延伸因子 (EF-2)上的ADP核糖基化失活，阻止了EF-2在核糖体内促进多肽链延长的作用，最终导致蛋白质合成被阻断，造成细胞死亡。白喉毒素经过甲醛脱毒处理，可以制成白喉类毒素（Diphtheria toxoid，DT）。白喉类毒素可以用作免疫佐剂或抗细菌感染疫苗的载体蛋白，然而必须经过较大体积的毒性物质处理过程方能制得，且有可能恢复毒性。

CRM197（Cross Reacting Material 197）是一种无毒的DT突变体，因其一个碱基G突变为A，使第52位氨基酸Gly（甘氨酸）突变为Glu（谷氨酸），导致天然毒素的ADP-核糖转移酶活性丧失，无法与EP结合，丧失了细胞毒性。CRM197和白喉毒素一样，由535个氨基酸（58.4 kD）组成单个多肽链，由两个亚基组成（通过二硫键连接），CRM197和白喉毒素的总体折叠几乎相同。CRM197不具有白喉毒素的酶活性和毒性，不会产生白喉类毒素毒性逆转效应，但具有白喉毒素的免疫原性，并且保留了完整的潜在结合位点赖氨酸氨基结构，故常作为一种理想的免疫蛋白载体而广泛应用于疫苗开发领域。

目前，全球范围内用于儿童流感嗜血杆菌疫苗，肺炎球菌和脑膜炎球菌等疫苗。另外除了作为结合疫苗的蛋白载体，还发现CRM197可以作为药物透过血脑屏障的载体，可作为肿瘤抑制剂开发新型抗肿瘤药物。

市售天然CRM197的低产量和高成本对其应用造成了极大限制。研究者和生产商均努力尝试构建其他细菌以提高CRM197产量同时降低成本。纵观全球，生产CRM197的表达系统主要有天然白喉杆菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌。其中无论是研究领域还是规模化生产，涉及最多的都是大肠杆菌。Hickey等（2018）的研究中针对来自3个表达系统生产的5个CRM197样品进行了理化性质和抗原性的评价。理化性质评价指标包括一级结构和翻译后修饰、高级结构、表面疏水性、电荷异质性等，结果显示尽管有一定的差异，但5个CRM197样品表现出高度的相似性；而在一系列抗体结合反应中，5个样品同样表现出基本相同的抗原性。以大肠杆菌表达系统生产的CRM197（临床前研究级）售价约为250美元/mg，从售价可侧面反应出大肠杆菌表达系统制造成本低的优势，也是更热门表达系统选项。

目前，在大肠杆菌系统表达的CRM197中，主要有包涵体表达和可溶性表达两种策略：

（1）CRM197在大肠杆菌包涵体表达

王春娥等（2008）将白喉棒状杆菌C7（β197）菌株（ATCC53281）基因组经表达载体pET-28a转化大肠杆菌BL21（DE3）表达带His标签的重组CRM197，发现CRM197主要以包涵体形式表达，相对分子质量约为60 000，凝胶电泳扫描分析，表达量约占菌体总蛋白的25%。包涵体经洗涤、溶解、金属螯合亲和层析等步骤，纯化得到纯度为95%以上的重组CRM197蛋白。并且与白喉抗毒素产生的特异反应，说明重组CRM197具有良好的反应原性。