[发明专利]一种融合蛋白CRM197及其制备方法

权利要求书

1.一种融合蛋白CRM197，其特征在于，所述融合蛋白CRM197的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白CRM197，其特征在于：融合蛋白采用大肠杆菌细胞表达制备。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白CRM197，其特征在于：所述的大肠杆菌为BL21。

4.一种融合蛋白CRM197及其制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1：全基因合成融合蛋白的DNA序列；

S2：通过基因工程技术连接目的片段与载体，获得含编码所述融合蛋白的DNA序列的重组大肠杆菌表达载体；

S3：将步骤S2所述的重组大肠杆菌表达载体转化到大肠杆菌感受态中，经测序成功后，将质粒转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白；

S4：对筛选高产菌株进行高密度发酵，经过酶切、第一步纯化和第二步纯化获取高纯度天然CRM197蛋白。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白CRM197及其制备方法，其特征在于：所述步骤S4中第一步纯化包括以下步骤：

S411：超声体系中按1g：1ul加入全能核酸酶去除DNA和RNA；

S412：柱平衡：将Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化填料装入纯化柱中，用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液进行平衡；

S413：上样：将样品进行上样，收集流穿样品，命名LC；

S414：用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl和10mmol 咪唑缓冲液冲洗填料，收集流穿液，命名为W；

S415：洗脱：分别用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和40mmol 咪唑缓冲液，20mmol pH为7.4的磷酸盐缓冲液、500mmol NaCl 和500mmol 咪唑缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，命名为E1，E2；

S416：用0.1 mol NaOH清洗填料，收集流穿液，命名为CIP；

S417：用大量蒸馏水冲洗填料，20%乙醇保存填料，SDS-PAGE进行蛋白样品的分析。

6.根据权利要求4所述的融合蛋白CRM197及其制备方法，其特征在于：所述步骤S4中第二步纯化包括以下步骤：

S421：SUMO酶切：将含有纯化His-SUMO-CRM融合蛋白的组分E2用30kD 密理博超滤管浓缩，将浓缩后的蛋白液置换成50mmol pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷和150mmol NaCl酶切缓冲液，按1g:1ml比例加入SUMO酶，4℃酶切过夜；

S422：样品预处理：将酶切后的蛋白液用30kD 密理博超滤管浓缩，将浓缩后的蛋白液置换成20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液；

S423：柱平衡：将Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化填料装入纯化柱中，用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和10mmol 咪唑缓冲液进行平衡；

S424：上样：将样品进行上样，收集流穿样品，命名LC；

S425：洗脱：用20mmol pH为8.0的磷酸盐缓冲液、250mmol NaCl 和40mmol 咪唑缓冲液冲洗填料，收集流穿液，命名为W；用20mmol pH为7.4的磷酸盐缓冲液、500mmol NaCl 和500mmol 咪唑缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，命名为E；

S426：用0.1mol NaOH清洗填料，收集流穿液，命名为CIP；

S427：用大量蒸馏水冲洗填料，20%乙醇保存填料，SDS-PAGE进行蛋白样品的分析；

S428：30kDa浓缩管进行蛋白样品的浓缩，BCA法测蛋白浓度，HPLC测定纯度。