[发明专利]一种促进NK细胞分化的iPS细胞系及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种促进NK细胞分化的iPS细胞系及其构建方法与应用，属于细胞技术领域。本发明提供一种促进NK细胞分化的方法，利用基因编辑技术在人类iPS细胞CD45基因座的特定位置敲入有利于向NK细胞分化的组合基因。这个组合基因伴随CD45的表达而表达，并发挥功能，例如膜结合型超级白细胞介素15(mbIL15s)基因。本发明通过构建造血祖细胞阶段特定表达增强mbIL15s的iPS细胞系，从而达到更好的维持基因修饰后的iPSC性能，减少NK分化早期iPSC‑EB阶段IL15干扰，同时提供mbIL15s促进造血祖细胞开始的NK分化与成熟的三重目标。

技术领域

本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种促进NK细胞分化的iPS细胞系及其构建方法与应用。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞在癌症治疗中的作用已被广泛证明。研究表明，供体自身NK细胞可以抑制异体基因造血干细胞移植后白血病治疗的复发，更重要的是同种异体NK细胞的输注已被证明能诱导和/或维持急性髓系白血病(AML)的缓解。与T细胞相反，同种异体NK细胞不会发生移植物抗宿主病，这个特点结合NK细胞的广谱抗癌活性，使NK细胞疗法成为一种新兴的免疫细胞肿瘤治疗选择。然而该疗法的一大瓶颈是如何获得足够治疗的均一性高的NK细胞。在人体中，NK细胞占循环淋巴细胞的8-20％，含量较低(相比T细胞60％以上的比例)，分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。考虑到个体成熟NK细胞之间还存在亚型差异，依靠人体外周血提取NK细胞很难满足临床治疗对免疫细胞生产的稳定性与均一性要求。

2006年日本科学家山中伸弥在世界著名学术期刊《细胞》上率先发表了关于成功制备诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，简称iPS细胞)的技术方法，并在2012年凭借此技术获得了诺贝尔生理医学奖。具体来说，iPSC技术利用特定的转录因子，可以将终末分化的体细胞(如外周血细胞、尿液细胞、皮肤细胞等)逆转为具有亚全能性的干细胞，即诱导性多能干细胞，这一逆转的过程即为细胞的重编程(Cell reprogramming)。由于iPS细胞具有与胚胎干细胞类似的亚全能性，具有在体外无限增殖的能力，并且可以分化为人体多种组织和器官细胞，如神经元、胶质细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、免疫细胞等，从而解决了细胞来源的问题，理论上可以在体外大量扩增并向特定组织细胞定向分化、获取足够数量和具有特定功能的细胞。十多年来科学家改进了体外分化的方法，开发了大量制备难以获取、难以扩增的特殊类型细胞的技术，同时为研究相关疾病的机制提供了全新平台。从iPS细胞体外分化为有功能的NK细胞(iNK)，为iNK细胞治疗多种疾病提供了可能的技术方法，并在将来进行临床转化用于肿瘤的治疗。

NK细胞的发育，存活和增殖需要细胞因子的刺激作用。其中细胞因子白细胞介素15(IL-15)在造血干细胞分化为NK细胞过程中对NK细胞的成熟至关重要。目前由iPSC分化制备NK细胞的方法中激活IL15通路信号主要有两种方法：1.分化过程中人为添加细胞因子IL15以促进NK细胞的成熟；2.通过基因修饰将IL15敲入iPSC中，通过细胞自身表达的IL15来提供NK细胞成熟过程所需的IL15刺激信号。但是，人为添加细胞因子IL15的方法大大增加了分化制备NK细胞的成本，并且人工生产的IL15因子不同厂商，不同批次以及运输使用过程等的差异和变动容易导致分化制备NK细胞的质量浮动，不利于工业化临床生产的稳定性保障。现有技术中的IL15敲入iPSC的技术是通过病毒转染(随机插入IL15基因)或者基因编辑将IL5敲入至人类基因组的特定位置来实现的。而病毒转染的方法中IL15是随机插入基因组，可能会带来其他基因位点由于插入造成基因激活或沉默，引发安全性风险，不利于临床应用；在AAVS1等安全基因座编辑敲入的IL15是从iPSC阶段就持续表达IL15因子，而IL15在iPSC和分化早期阶段会影响细胞的存活和分化能力。

发明内容