[发明专利]一种立体选择性羧酯酶、编码基因、载体及其应用

说明书

本发明公开了一种立体选择性羧酯酶、编码基因、载体及其应用。本发明的立体选择性羧酯酶对多种环烷烃甲酯类底物具有较高的活力，利用本发明所述的羧酯酶催化动力学拆分环烷烃甲酯类底物时，反应条件温和，操作过程简便，易于放大；通过该动力学拆分反应制备所得的手性酸产物浓度高，光学纯度高，ee值可达99％，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及一种立体选择性羧酯酶、编码基因、载体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

(S)-氧杂环己烷-2-甲酸((S)-THPCA)是一种重要的手性化工原料和医药中间体，广泛的应用于手性合成领域，特别是在手性药物制备方面，也是药物的重要手性构建块，如针对II型糖尿病的Danuglipron(PF-06882961)，其需求量在飞速的增长。由于氧杂环己烷-2-甲酸酯连接到手性中心的两个取代基差异很小，很少有报道的酶具有对映体选择性来区分杂环羧酸酯的两个对映体。此外，使用手性助剂的杂环羧酸酯的化学拆分也具有挑战性，这也是因为其特殊的对称结构。因此鉴定具有高对映体选择性的新型羧酸酯酶，对高效合成手性氧杂环羧酸及其衍生物，阐明羧酸酯酶对映体选择性的分子机理具有重要意义。

用于生物法制备(S)-THPCA的生物催化剂既可以是整细胞，也可以是酶。因为细胞内含有多种酶，整细胞催化往往会遇到副反应的问题，副反应的存在会降低目标反应产物的得率。对于拆分氧杂环己烷-2-甲酸酯这种一步反应来说，酶法催化更具优势，既可以彻底避免副反应的问题，也可以克服细胞膜阻碍底物和产物跨膜传递的问题。因而，通过基因工程技术高产酯酶，将为其在氧杂环己烷-2-甲酸酯中的应用奠定良好的基础。

羧酯酶(Carboxylesterases，EC 3.1.1.1)是一类催化酯键(羧酯键、酰胺键、硫酯键等)水解和合成的酶。工业应用的羧酯酶多数来自微生物，这类微生物从分类上看主要是真菌，主要包括黑曲霉、链孢霉、青霉、黄曲霉、毛霉、犁头菌、红曲霉、根霉、白地霉、核盘菌、酵母菌和须霉等12属23种；其次是细菌，包括伯克霍尔德属、葡萄球菌属、假单胞菌属及芽孢杆菌属等。这些野生菌中羧酯酶含量较低并且比较杂，利用其作为生物催化剂进行大规模的工业化生产存在一定的难度，因而构建羧酯酶基因工程菌从而大量生产重组羧酯酶具有十分重要意义。因此针对氧杂环己烷-2-甲酸酯化合物，亟需筛选高效和高选择性的生物催化剂，以满足工业需要。

发明内容

为解决上述问题，本发明针对现有的生物催化动力学拆分氧杂环己烷-2-甲酸酯制备(S)-THPCA的反应中，可提供该反应的羧酯酶报道较少的问题，提供一种具有优异的不对称催化活性、立体选择性好的羧酯酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及重组酶和该重组酶的制备方法，以及该羧酯酶或其突变重组酶的应用。

本发明的第一个目的是提供一种立体选择性羧酯酶，所述的立体选择性羧酯酶是如下(a)或(b)的羧酯酶：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶；

(b)由(a)中所述羧酯酶经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的具有羧酯酶活性的衍生蛋白质。

SEQ ID NO.2的序列具体如下：

MAIRETVGVDGTPLVYSVTGDPDARALVLLHGWAQSSKCWGPGVLDELAARYRVIAVDLRGHGYSGAPDTGYDDSAVWAGDVDAVLTAEGVTSGAVLLGWSYGGLVICDYLASNGTSAVDGVVLVGAITSIGRGEAGGKVGAAMRAAIPGAMSEEPREAIRALGAFGNALTGPPEGKGAQSQALFGASLTTPPRVRAALFNRSASHDDLLRSLDVPVLVLHGTEDSVVDVSAGRHAAELIPQARASFWEGCDHGPFVEDPERFVKEVGEFVDNLG。