[发明专利]利用人脱落乳牙牙髓干细胞生成骨类器官的组合物及骨类器官生成方法

权利要求书

1.一种骨类器官诱导培养基，其特征在于，其组分含有：0.5-1.5％青霉素/链霉素、1×L-谷氨酰胺(GlutaMAX)、10-20％胎牛血清(FBS)、50-150μM/mL抗坏血酸、1-3mM b-甘油磷酸钠、1.2-2.4mM磷酸二氢钾、5-15nM地塞米松和α-MEM最小需求培养基。

2.一种利用人脱落乳牙牙髓干细胞生成骨类器官的组合物，其特征在于，其包括第一组分、第二组分和第三组分；

所述第一组分为人脱落乳牙牙髓干细胞复苏培养基，所述人脱落乳牙牙髓干细胞复苏培养基的组分含有：0.5-1.5％青霉素/链霉素、1×L-谷氨酰胺(GlutaMAX)、5-15％胎牛血清(FBS)和α-MEM最小需求培养基；

所述第二组分为骨类器官诱导培养基，所述骨类器官诱导培养基的组分含有：0.5-1.5％青霉素/链霉素、1×L-谷氨酰胺(GlutaMAX)、10-20％胎牛血清(FBS)、50-150μM/mL抗坏血酸、1-3mM b-甘油磷酸钠、1.2-2.4mM磷酸二氢钾、5-15nM地塞米松和α-MEM最小需求培养基；

所述第三组分为将培养的人脱落乳牙牙髓干细胞进行消化为单细胞的胰蛋白酶，所述胰蛋白酶为含0.25％EDTA的胰蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括3D细胞培养基质胶。

4.一种体外骨类器官的生成方法，其特征在于，包括：使用权利要求2所述的组合物并采用人脱落乳牙牙髓干细胞SHED来生成骨类器官；所述生成方法包括如下步骤：

S1、采用所述第一组分复苏人脱落乳牙牙髓干细胞过夜；

S2、使用所述第三组分将细胞消化为单细胞悬液；

S3、使用3D细胞培养基质胶包被人脱落乳牙牙髓干细胞单细胞，等待基质胶凝固；

S4、将经S3处理的牙髓干细胞接种到所述第二组分中，静置培养；

S5、于接种第3天完全更换新鲜的第二组分，接下来每间隔1天更换一次所述第二组分，以维持培养；

S6、于接种第14天，对S5培养的骨类器官消化传代，消化后的细胞按步骤S3-S6的方法继续扩大培养。

5.根据权利要求4所述的体外骨类器官的生成方法，其特征在于，S3中的包被方法为:按照3D细胞培养基质胶：细胞悬液的体积比为4：1的比例混合包被。

6.根据权利要求5所述的体外骨类器官的生成方法，其特征在于，按照基质胶：细胞悬液的体积比为4：1的比例，配制成混悬液并接种于培养孔板，每孔接种混悬液的体积为50μL±1，然后放入37±0.2℃、5％CO₂培养箱，静置20min，尽量避免移动，待基质胶凝固。

7.根据权利要求4所述的体外骨类器官的生成方法，其特征在于，S3-S5的培养环境均为37±0.2℃、5％CO₂培养箱。

8.根据权利要求4所述的体外骨类器官的生成方法，其特征在于，S6使用类器官回收液对S5培养的骨类器官消化传代。

9.根据权利要求4所述的体外骨类器官的生成方法，其特征在于，S6中，接种培养至第14天，使用移液枪，吸净培养孔板中各孔上清，沿着培养孔板壁加入480-520μL/孔的类器官回收液，冰上孵育60-90min，至基质胶完全溶解；基质胶完全溶解后，使用移液枪收集培养孔板中各孔内混合液置离心管中，离心弃上清后使用TrypLE重悬，放入37±0.2℃、5％CO₂培养箱孵育5-10min消化，消化结束离心弃上清后，收集的类器官单细胞再次按S3-S6的培养方法继续培养。