[发明专利]一种生防菌及其在水稻细菌性条斑病防治方面的应用

权利要求书

1.一种生防菌，其特征在于包括如下分离筛选步骤：

初筛：从常年发生水稻细菌性条斑病的田间选取长势良好的水稻植株，取其根围土，根围土风干，取风干过筛土10g，放入含有90mL灭菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡20-30min，即成10倍悬液，取10-4、10-5浓度的悬浮液0.2mL加入已备好的LB培养基表面，涂布平板，28℃恒温培养，挑取不同菌落形态菌落备用；

复筛：水稻细菌性条斑病RS105在培养基培养48h后，接种至50mL培养液，28°C、150r、min−1振荡培养48h，取0.3mL病原菌液均匀涂布在平板上，然后在每个带菌平板上放置3个灭菌的、直径6mm的滤纸片，在滤纸片上滴入10μL含菌量为109cfu⋅mL−1的拮抗菌液，25°C培养48h，测量各菌株的抑菌圈直径；

分子生物学鉴定：取上述筛选获得的生防菌菌体，采用DNA快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组DNA；再采用PCR扩增试剂盒扩增该生防菌的gyrB基因片段，以上述提取的基因组DNA产物为模板；扩增采用的正向引物序列为：5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3；扩增采用的反向引物序列为：5-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3；这两条引物序列中的“N”表示A/G/C/T中的任意一种碱基，“R”表示A/G的中的任意一种碱基，Y代表C/T中的任意一种碱基；接着用水平电泳检测PCR产物，扩增条带使用DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收，回收的样品进行序列测定；将测序结果进行同源性比较，最得出生防菌。

2.根据权利要求1所述的一种生防菌，其特征在于：所述分子生物学鉴定步骤中，同源性比较时，与已知细菌的gyrB基因片段序列进行相似性比对，所述初筛步骤中过筛的筛网为2mm，该生防菌为为蜡质芽孢杆菌。

3.根据权利要求1所述的一种生防菌，其特征在于：所述LB平板的配方为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2。

4.根据权利要求1-3任一项所述的一种生防菌在水稻细菌性条斑病防治方面的应用，其特征在于包括如下步骤：

培养：将培育出的蜡质芽孢杆菌在LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑单菌落接入含有5mlLB培养液的试管中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，作种子液；按照1:100的比例将种子液接于500mL的LB培养液中，置于28℃、200转/分钟的摇床上培养48h，至其活菌总浓度为5×109CFU/ml。

5.防治应用：在农作物移栽后，立刻用上述培养获得的菌液稀释100~200倍对移栽的农作物进行灌根，同时进行叶面喷施。

6.温室防病试验：

一：用培养48h新鲜的细菌性条斑病菌RS105菌液接种成株期的水稻植株，每处理接种6穴水稻，24片叶，接种后立即用培养36h、含菌量为109cfu⋅mL−1的拮抗菌菌液进行喷雾，每处理喷雾100mL菌液，空白培养液为对照；14d后测量条斑病病斑大小，计算防治效果；

二：用蜡质芽孢杆菌的菌液对生长14d的水稻进行灌根法处理，每颗苗灌20ml；此为实验组；

三：同时，采用灌根法、每颗苗浇灌20ml清水作为对照组；

四：用新鲜培养的细菌性条斑病菌RS105菌液接种对上述三个实验中的水稻植株，20-25℃保湿，每天观察各组情况，待对照组出现发病情况后，开始统计发病情况。

7.根据权利要求4所述的一种生防菌及其在水稻细菌性条斑病防治方面的应用，其特征在于：所述温室防病试验中，所提的步骤二为水稻细菌性条斑病试验的实验组，所提的步骤三为水稻细菌性条斑病试验的对照组。