[发明专利]敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明采用裂殖壶菌Schizochytrium limacinum SR21为原始菌株，通过基因工程手段在大肠杆菌中构建敲除载体，以PLD基因的上下游序列作为同源臂，以博来霉素基因替换PLD基因并作为筛选抗性基因，得到一株高产DHA的基因工程菌株，为基因工程调控裂殖壶菌高产DHA提供了新的思路。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

裂殖壶菌(Schizochytrium)作为多不饱和脂肪酸(PUFAs)的优质生产者，因其生长速度快、油脂含量高、DHA比例高，是工业化生产PUFAs和DHA的代表性菌株。国内外科学家对于裂殖壶菌中PUFAs的合成机制进行了广泛的研究，发现裂殖壶菌PUFAs合成的途径包括脂肪酸合成酶(FAS)途径和聚酮合成酶(PKS)途径，其中裂殖壶菌DHA合成被认为主要与PKS途径有关。最近的研究发现裂殖壶菌中DHA的生产不仅仅取决于DHA的合成过程，还取决于DHA合成后迁移、积累和储存的装配形式。裂殖壶菌中DHA的储存形式主要为甘油三酯，还有的是以磷脂和甾醇酯形式存在，甘油酯、磷脂和甾醇酯相互转化的过程中也会伴随着脂肪酸的迁移，其过程与磷脂代谢密切相关。因此优化裂殖壶菌的磷脂代谢过程对于裂殖壶菌DHA合成具有重要意义。

磷脂酶D专一性水解磷脂中的磷酸二酯键，主要催化两类反应：(1)水解反应；(2)转磷脂酰反应。磷脂酶D能够通过水解作用调节TAG和磷脂的分配，也能够通过转磷脂酰作用使不同类型磷脂之间发生转化。调控磷脂酶D的表达会影响裂殖壶菌的磷脂代谢，进而会对裂殖壶菌的油脂及DHA合成产生影响。但截止目前还没有在裂殖壶菌中调控磷脂酶D影响裂殖壶菌油脂合成和脂质储存形式的报道。

发明内容

本发明的目的在于从一定程度上解决了现有技术的不足之处，提供了敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明以Schizochytriumlimacinum SR21为原始菌株，通过敲除PLD基因来调控裂殖壶菌脂质储存形式，进而加强DHA的合成。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种敲除磷脂酶D(PLD)基因的裂殖壶菌基因工程菌株，所述基因工程菌株是以Schizochytrium limacinum SR21为原始菌株构建而成，所述基因工程菌株的基因组中PLD基因被敲除，降低了所述基因工程菌株中的PLD表达水平。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株的构建方法，包括：

(1)克隆来源于野生型菌株Schizochytrium limacinum SR21基因组中PLD基因的上下游同源臂，插入到pBlue-zeo质粒的同源重组区域，构建以博来霉素为抗性的PLD基因敲除载体pBlue-zeo-PLD；

(2)用所述PLD基因敲除载体pBlue-zeo-PLD的同源重组区域线性化后，电转化导入Schizochytrium limacinum SR21感受态细胞中，获得敲除磷脂酶D基因PLD的裂殖壶菌基因工程菌株。

进一步地，所述步骤(1)中，PLD基因敲除载体pBlue-zeo-PLD的构建方法包括：根据裂殖壶菌Schizochytrium limacinum SR21的PLD基因的序列信息，设计如SEQ ID No.3～SE1 ID No.6所示的引物，通过PCR扩增得到PLD基因上游同源臂和PLD基因下游同源臂；将得到的PLD基因上游同源臂和PLD基因下游同源臂依次与质粒pBlue-zeo经酶切、连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得所述敲除载体pBlue-zeo-PLD。