[发明专利]一种基于MLPA技术对菟丝子、油菜籽、莱菔子进行鉴定的方法

说明书

本发明公开了一种基于多重连接探针扩增技术对菟丝子、油菜籽、莱菔子进行鉴定的方法，它包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA；2)以基因组DNA为模板，设计特异性引物扩增ITS2序列；3)将扩增产物变性后与MLPA探针进行杂交；4)将杂交产物进行连接；5)利用通用引物对连接产物进行实时荧光定量PCR扩增；6)收集熔解曲线信号，观测Tm值。本发明能够在较短的时间内鉴别菟丝子、油菜籽、莱菔子，可有效检测出掺混样品，该方法具有特异性强，灵敏度高等优点，在中药材真伪鉴定领域有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于中药材鉴定领域，具体涉及一种用于鉴定菟丝子、莱菔子、油菜籽的多重连接探针扩增方法(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)。

背景技术

中药菟丝子为旋花科植物南方菟丝子Cuscuta australis R.Br.或菟丝子Cuscuta chinensis Lam的干燥成熟种子，主产于山东、内蒙古、河北、安徽等地，具有补益肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻等功效，在《神农本草经》中被列为上品。菟丝子为寄生植物，因生长环境和自身繁殖方式的限制，致使其资源短缺，价格逐年攀升，市场上流通的菟丝子药材中常出现掺伪、造假的现象，使其中药材质量下降。常见伪品有十字花科萝卜属植物萝卜Raphanus sativus L.的种子(习称莱菔子)和十字花科芸苔属植物芸苔Brassicacampestris L.的种子(习称油菜籽)，由于种子形态相近，利用传统鉴别方法难以将三者区分，因此，为了临床用药安全、有效、精准，建立一种高效快速鉴别菟丝子及其混伪品的方法尤为重要。

多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术是一种近几年发展起来的可以在单一反应管内同时对多个不同靶基因进行定性和半定量分析的核酸检测技术。其原理是利用MLPA探针与靶序列杂交，然后通过连接酶进行探针的特异性连接，再用一对通用引物进行PCR扩增，最后利用毛细管电泳进行分离分析。该技术具有高通量、高特异性、检测速度快且操作简便等特点，目前，在病原微生物的检测、肿瘤和遗传性疾病的诊断以及中药材真伪鉴定等领域已有广泛应用。然而传统的MLPA产物分析方法存在一些局限，进行毛细管电泳不仅费钱费时，而且将PCR产物取出过程中可能会出现交叉污染的风险。本发明在传统MLPA技术上引入熔解曲线分析，并针对菟丝子、莱菔子、油菜籽核基因片段序列的变异位点设计了特异性MLPA探针，从而由熔解曲线分析获取扩增产物的熔解温度，根据熔解温度的差异来鉴别菟丝子、莱菔子、油菜籽。本发明缩短了样品检测周期，降低了实验成本，且为闭管操作避免了污染。本发明实现了菟丝子、莱菔子、油菜籽的药材鉴定以及相互掺杂的快速检测，为临床用药安全和市场监管提供了有力技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速鉴别菟丝子、莱菔子、油菜籽的方法，该方法针对药材的核基因序列设计特异性探针，采用MLPA技术并结合熔解曲线，不仅提高了三种药材的检测效率，同时还具有很高的检测灵敏度和特异性。

为实现上述目的，本发明使用了以下技术手段：

一方面，本发明提供了用于鉴定菟丝子、莱菔子、油菜籽的MLPA探针，所述探针共三组，分别由左探针(Left Probe Oligonucleotide,LPO)和右探针(Right ProbeOligonucleotide,RPO)组成，探针序列如下：

菟丝子探针：

LPO：5′-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGTCGCCGTGGTTGGCCGAAAGTATTGTCCGTGATTTT-3′(SEQ ID NO:1)

RPO：5′-GTTGATGTCTTGGCGTGCGGTGGATGGGGCGGGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC-3′(SEQ ID NO:2)

莱菔子探针：