[发明专利]一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母菌的构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种表面展示β‑半乳糖苷酶的重组毕赤酵母菌的构建方法与应用，所述重组毕赤酵母菌是在原始毕赤酵母Pichia pastoris GS115中异源表达来源于米曲霉BK03的β‑半乳糖苷酶基因lacA与来源于酿酒酵母的细胞壁蛋白Flo1p。本发明通过将β‑半乳糖苷酶通过表面展示技术展示在细胞表面，酶的稳定性更好；同时，β‑半乳糖苷酶能够更多次地被重复利用，产低聚半乳糖的量较高。

技术领域

本发明涉及酶的基因工程领域，具体涉及一种表面展示来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶lacA的重组毕赤酵母菌的构建方法与应用。

背景技术

表面展示是一种利用锚定蛋白将外源靶蛋白展示在细胞表面的技术。酵母菌株是众所周知的安全性菌株，酵母是真核生物，具有真核细胞蛋白质折叠、mRNA加工、蛋白水解、糖基化和异构化等功能。酵母表面展示技术是通过外源靶蛋白基因与特定的锚定蛋白基因融合形成融合蛋白，连入相关载体并导入酵母细胞，在酵母细胞内蛋白转运机制的引导下将靶蛋白表达定位于酵母细胞表面。通常选择细胞壁外层的甘露糖蛋白充当锚定蛋白，外源靶蛋白和锚定蛋白主要有两种融合方式：C端融合和N端融合。用锚定蛋白将外源蛋白展示在细胞表面，稳定性良好。β-半乳糖苷酶在医学、食品等方面应用广泛，毕赤酵母表面展示系统有良好的发展前景，用锚定蛋白将来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶lacA展示在毕赤酵母细胞表面，其展示的酶比较稳定，适合充当全细胞催化剂，近些年来对毕赤酵母表面展示系统的研究越来越多。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明实际要解决的技术问题是提供一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组毕赤酵母菌的构建方法。

本发明进一步要解决的技术问题是提供上述重组毕赤酵母的诱导表达方法。

本发明进一步要解决的技术问题是提供上述重组毕赤酵母发酵产低聚半乳糖中的应用。

发明思路：本发明旨在通过酵母表面展示技术将来源于米曲霉BK03的β-半乳糖苷酶lacA基因展示表达在原始毕赤酵母Pichia pastoris GS115细胞表面，获得一株能够合成低聚半乳糖的重组毕赤酵母菌株。通过对重组菌株固定化细胞固定化酶的研究，测定酶活和产量变化，获得一株高产低聚半乳糖的毕赤酵母表面展示菌株。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母菌，在原始毕赤酵母Pichia pastoris GS115中异源表达来源于米曲霉BK03的β-半乳糖苷酶基因lacA与来源于酿酒酵母的细胞壁蛋白Flo1p。

其中，所述β-半乳糖苷酶基因lacA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，所述细胞壁蛋白Flo1p的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述重组毕赤酵母菌的构建方法，在原始毕赤酵母Pichia pastoris GS115中导入携带Flo1p和lacA的重组质粒pPIC9k-Flo1p-lacA。

具体地，所述毕赤酵母表面展示β-半乳糖苷酶lacA重组毕赤酵母菌的构建方法包括如下步骤：

(1)以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的基因组为模板构建锚定蛋白Flo1p的表面展示表达原件；